Progestágenos y cáncer de mama

Claudia Lanari, Investigadora Independiente de CONICET y jefe del Laboratorio de Carcinogénesis Hormonal del Instituto de Biología y Medicina Experimental.

Alfredo A. Molinolo, Investigador de Fundación Sales.

Buenos Aires- e-mail: clanari@dna.uba.ar

El término genérico cáncer de mama se refiere a la proliferación neoplásica maligna originada en el compartimiento epitelial ya sea de estructuras ductales o lobulares de la glándula mamaria, siendo el más común, el carcinoma ductal. Este cáncer, según los informes de la Organización Mundial de la Salud constituye la neoplasia maligna más común en la mujer en el mundo occidental. Es la segunda causa de muerte por cáncer en Estados Unidos (1). Su incidencia es similar en Argentina y las tasas de mortalidad muestran un incremento sostenido.

La mayoría de los factores epidemiológicos de riesgo del carcinoma mamario se asocian a una estimulación intensa y/o prolongada por hormonas sexuales femeninas. Dentro de los factores relacionados con hormonas podemos considerar los siguientes:
Historia menstrual y reproductiva; menarca temprana, menopausia tardía, preñez a término tardía y obesidad.
Lactancia: El riesgo se reduce en mujeres premenopáusicas que amamantan, pero no entre las posmenopáusicas con historia de lactancia (2).
Hormonas exógenas: los estrógenos exógenos, solos o combinados con progestágenos, elevan el riesgo de cáncer de mama (3). Para los progestágenos el riesgo relativo estimado fue 1.1 (95% IC,0.99-1.2) para los contraceptivos orales y 1.09 (95% IC, 0.89-1.2) para los inyectables (4). El riesgo de cáncer de mama es mayor con el uso de progestágenos combinados con estrógenos, ya sea en forma secuencial o continua, que con el uso de estrógenos solos (5). Con anticonceptivos, parece haber un aumento bajo entre las mujeres jóvenes con consumo prolongado (6). En un meta-análisis de datos provenientes de 51 estudios epidemiológicos de la relación entre riesgo de cáncer de mama y terapia de reemplazo estrogénico durante la menopausia se observó un riesgo aumentado con el uso de la terapia de reemplazo por más de 5 a 10 años (7). Con el fin de disminuir los efectos adversos de estrógenos en útero se comenzaron tratamientos combinados de estrógenos y medroxiprogesterona en la terapia hormonal de reemplazo. Los mismos tuvieron que suspenderse debido al aumento “inesperado” de carcinomas mamarios (8;9). Modelos de investigación.

1) Tumores inducidos por carcinógenos. Entre los varios modelos que se han desarrollado podemos mencionar los tumores inducidos por metilnitrosourea (MNU) y dimetilbenz(a)antraceno (DMBA) en ratas, que son hormono-respondedores y expresan receptores de estrógenos (RE) (10;11). En ratones tanto el MNU (12;13) cono el DMBA (14) inducen carcinomas mamarios en animales tratados con progestágenos aunque los tumores inducidos no son hormono-respondedores.

2) Tumores inducidos por la administración de hormonas. Hay muy pocos modelos en los cuales la administración de una hormona lleva a la aparición de carcinomas mamarios. Entre ellos podemos citar al modelo desarrollado en nuestro laboratorio usando progestágenos y al modelo de la cepa ACI de rata en la cual aparecen carcinomas mamarios por administración de estrógenos (15).

3) Tumores asociados a virus oncogénicos. Las cepas endocriadas de ratones como C3H, poseen alta incidencia de tumores mamarios, debido esencialmente a la presencia del retrovirus MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus). Los tumores desarrollados por estas cepas suelen ser lobulillares y en general no expresan RE y de progesterona (RP), razón por la cual actualmente no se los considera un modelo óptimo para el estudio de los carcinomas mamarios humanos. Las cepas europeas como la GR, y la variante BALB/c recientemente generada en la Academia Nacional de Medicina (16) generan tumores que expresan RE y RP, pero, a diferencia de los humanos, son dependientes de preñez (17). El poliomavirus se ha utilizado para el desarrollo de carcinomas mamarios ductales en ratones adultos inmunosuprimidos o en neonatos normales (18).

4) Implantes tumorales humanos en animales de laboratorio. Para estos estudios se utilizan ratones atímicos o “nude” (nu/nu), para prevenir el rechazo de los tejidos tumorales humanos o de líneas celulares derivadas de tumores. Las condiciones de cría y cuidado de estos animales son extremadamente costosas.

5) Ratones genéticamente modificados. La investigación con animales transgénicos o knock-out (organismos con una supresión específica de un gen) permite una integración completa del órgano en estudio y sus distintos tipos celulares con el status hormonal y fisiológico del animal. En los últimos quince años, su utilización en el estudio de cáncer de mama humano ha sido documentada en más de cien artículos (19). Podemos citar, entre otros, a ratones modificados en los oncogenes c-myc, v-Ha-ras, c-neu, wnt-1, los genes supresores de tumores p53, BRCA 1 y BRCA 2, y genes de la maquinaria celular como el gen de la ciclina D1. Para lograr especificidad tisular, algunos genes se encuentran bajo el control del promotor de MMTV. Es un excelente modelo in vivo, pero en muchos casos surgen tumores en otros tejidos, no se desarrollaron tumores de mama (como los ratones BRCA 1 +/- y BRCA 2 +/-) o los tumores generados resultaron morfológicamente distintos a los tumores de mama humanos (20).

6) Líneas celulares. Las líneas celulares son valiosos modelos a la hora de analizar ciertos aspectos de la biología celular del cáncer de mama. Sin embargo, células transformadas aisladas creciendo en un frasco de cultivo están sometidas a estímulos distintos a los de células in vivo y esto debe ser tenido en cuenta a la hora de la interpretación de los resultados y al extraer conclusiones. Carecen, entre otros factores, de una verdadera interacción epitelio, estroma y matriz, estructura tisular, respuesta inmune del huésped, exposición a hormonas y a factores ambientales, etc.; y, consecuentemente, pueden diferir del tumor que les dio origen. No obstante, la homogeneidad, reproducibilidad y manipulación ex profeso de las condiciones de cultivo hacen de las líneas celulares buenas herramientas de investigación.
Desde que Lasfargues desarrollara la primera línea celular humana de cáncer de mama en 1958 (21), se han establecido muchas líneas celulares. La línea celular de cáncer de mama por antonomasia es la MCF-7, desarrollada en 1973 a partir de un derrame pleural de un carcinoma de mama humano (22). Además de la MCF-7, las líneas celulares más utilizadas son la T-47D (23) y la ZR-75-1 (24). En los últimos años se han desarrollado nuevas líneas celulares, entre ellas se encuentran las recientemente desarrolladas por la Dra Isabel Lüthy (Journal of Cell Physiol, en prensa). Un problema vinculado a la investigación con las líneas celulares humanas inoculadas en ratones inmunosuprimidos es que no desarrollan metástasis, a diferencia de los xenotransplantes de tumores humanos (25).
Se han establecido pocas líneas celulares de ratón, la mayoría de las cuales no expresan RE y RP. Entre ellas, podemos citar a la línea BALB/c-MC (26) y MG1361 (27). En la Argentina se han establecido varias líneas celulares de ratón, como la LM3 y la LMM3 (28), la LM2 (29) y las desarrolladas en nuestro laboratorio que sí expresan receptores hormonales (30).

En el año 1985 desarrollamos el modelo de inducción de carcinomas mamarios murinos por MPA. Se inocularon ratones hembra BALB/c de dos meses de edad (Bioterio de la Academia Nacional de Medicina) cada tres meses con 40 mg de MPA de depósito (depot) sc en el flanco. Los ratones desarrollaron carcinomas mamarios con una incidencia actuarial de 80% y una latencia de aparición de 52 semanas (31). Como rasgos llamativos de autopsia se observaron hiperplasias glándulo-quísticas y deciduomas uterinos e hipertrofia de las glándulas salivales. En estudios de montajes de glándulas mamarias completas se observaron distorsiones en la arquitectura y grosor de los conductos además de hiperplasia paraductal. Posteriormente en otro esquema de administración usando implantación de pellets de 40 mg con reposición a los seis meses, la incidencia de carcinomas mamarios también fue alta y de histología casi única ductal (32). Como se describirá más adelante, la misma cantidad de progesterona indujo también tumores de mama pero de histología lobulillar.

Se encontraron RE y RP en todos los carcinomas mamarios ductales (33;34), llegando a valores mayores de 1000 fmoles / mg de proteína para RP y valores de más de 500 fmoles / mg de proteína para RE. El valor de Kd para RP fue del rango de 5-7 nM y para RE: 0.8-10 nM. En todos los tumores estudiados se expresó receptor de prolactina con valores similares a los obtenidos de tumores provenientes de hembras BALB/c multíparas que se utilizaron como controles (Kd: 0.32 nM, rango: 6-27 fmoles / mg de proteína, n=7). Sólo se detectaron receptores de factor de crecimiento epidérmico (R-EGF) en muy bajas cantidades y en algunos casos no fue detectable. Estos receptores se expresaron altamente en tumores lobulillares mamarios también inducidos por MPA o en los tumores de hembras multíparas usadas como control.
Posteriormente encontramos dos sitios receptores de RP por técnicas de unión al ligando, el clásicamente descripto y uno de muy alta afinidad y poca capacidad, ambos desplazables por antiprogestágenos (35).

Los tumores se transplantaron con un trocar en el flanco derecho (s.c.) de hembras vírgenes BALB/c. Simultáneamente, los animales recibieron MPA (s.c.) depot (20 mg) en el flanco izquierdo. En todos los pasajes se dejó un animal sin tratamiento como control. Todos los adenocarcinomas mamarios ductales que expresaban receptores hormonales crecieron en ratones tratados con MPA y en los animales sin tratar sólo crecieron luego de dos meses de inoculado el tumor. Para el pasaje siguiente se utilizaron los tumores que crecían en los animales tratados con MPA (36).
Los tumores crecieron muy lentamente luego de dos meses si eran transplantados en ratones sin MPA y luego de 6-8 meses en ratones ovariectomizados (ovx) (36). Los tumores no crecieron en animales ovx y adrenalectomizados (adx) (37). Por otro lado, los tumores crecieron luego de una semana tanto en ratones tratados con MPA o Pg. El crecimiento tumoral se retrasó en animales ovx tratados con MPA comparado con animales tratados con MPA pero no ovx. Un tumor PD es definido como tal cuando crece en animales tratados con MPA y muy poco, seguido de regresión, en animales sin tratar durante los primeros dos meses de haber sido inoculado.

Se investigó la habilidad del MPA de inducir tumores mamarios en animales ovx y sialoadenectomizados (sdx) (sin glándulas salivales). Se observó una disminución significativa de la incidencia tumoral mamaria en ambos casos (34). Los tumores que crecieron, mostraron los mismos patrones histológicos y biológicos que los tumores inducidos en hembras intactas. Estudios histológicos mostraron que las glándulas mamarias eran hipoplásicas en animales ovx y sdx sugiriendo que las hormonas ováricas y el EGF de la glándula salival podrían favorecer la carcinogénesis inducida por MPA. El hecho de que la administración exógena de EGF aumentó la hiperplasia inducida por MPA en la glándula mamaria de ratones sdx sugiere que ambos factores podrían coactuar para inducir tumores mamarios (38). Se encontraron niveles altos de EGF sérico en animales tratados con MPA, mientras que niveles similares a los controles se encontraron en los animales sdx y tratados con MPA.

Investigamos si el MPA es capaz de inducir tumores mamarios en otras cepas de ratones. Para esto utilizamos el mismo protocolo usado para inducir tumores mamarios en ratones BALB/c. Con la cepa C57/Bl el experimento no se pudo concluir debido a las ulceraciones en la piel observadas principalmente en los ratones tratados con MPA, pero que también se observaron en ratones controles mayores de 7-8 meses. Durante este período no aparecieron tumores mamarios. En el momento actual se están repitiendo estos experimentos no detectándose tumores luego de un año de tratamiento. En los ratones C3H, se observó un aumento de la incidencia tumoral en los ratones tratados con MPA, aunque marginalmente significativo, ya que en hembras no tratadas ya se observa una alta incidencia de tumores mamarios. Los tumores inducidos por MPA fueron histológica y biológicamente idénticos a los tumores espontáneos observados en esta cepa (36). Estos resultados sugieren que la cepa BALB/c es especialmente adecuada para estudiar carcinogénesis inducida por MPA.

La administración de Pg a ratones hembra BALB/c también indujo adenocarcinomas mamarios (32). La mayoría de los tumores fueron de tipo lobulillar precedidos por lesiones preneoplásicas lobulillares, morfológicamente diferentes de aquellos inducidos por MPA. Solo se observaron 2/9 tumores ductales mamarios.

Ocasionalmente, algunos tumores PD comienzan a crecer en ratones no tratados. En estos casos, surge una nueva variante PI que es mantenida por transplantes en ratones no tratados. Para continuar con la línea parental (PD) se utilizan células de pasajes anteriores. Los tumores progestágeno independientes (PI) ductales expresan, al igual que sus parentales, altos niveles de RE y RP y bajos niveles de R-EGF. En contraste a los tumores PI lobulillares que no expresan RE y RP pero sí tienen altos niveles de R-EGF. Los tumores ductales de crecimiento PI pueden ser inhibidos por E2, y/ó antiprogestágenos mifepristona (RU 486) y onapristona (ZK 299) mientras que la flutamida (Flu, antiandrógeno) no altera el crecimiento tumoral. Estos resultados sugieren que los receptores esteroides aún siguen participando en el crecimiento tumoral PI. El tamoxifeno fue inhibitorio del crecimiento tumoral aunque no se observó regresión tumoral comparable a la de estrógenos o antiprogestágenos (39). El raloxifeno por otra parte no ejerció efectos inhibitorios del crecimiento tumoral. Existen sin embargo variantes que se vuelven resistentes al tratamiento hormonal y las llamamos tumores progestágeno independientes no respondedores (40).

Se demostró la presencia de ambas isoformas de RP, la A y la B, en todos los tumores PD y PI respondedores sin encontrarse diferencias algunas entre ambos tipos de tumores, y una banda inmunoreactiva de 78kDa también observada en carcinomas de mama humanos y de perros cuya función no se conoce. Bandas de peso molecular aproximado de 100 kDa compatibles con la observada por el grupo de Price (41) para RP de membrana también fueron observadas en muestras de extractos totales. Los tumores no respondedores por otro lado mostraron una significativa baja expresión de bandas. Sin embargo, por inmunohistoquímica usando tres anticuerpos diferentes todos los tumores mostraron alta expresión nuclear de RP (40). Curiosamente tampoco encontramos diferencias en el WB cuando se estudian RP fosforilados en ser294. Todos son igualmente inmunoreactivos. Estos resultados sugieren que los tumores PD y PI respondedores no difieren en cuanto a la expresión de RP, en cambio los no respondedores tendrían RP modificados por lo cual son reconocidos por algunas técnicas y no por otras. Resultados prelimares del laboratorio sugieren que siguen siendo funcionales, ya que el bloqueo de los mismos con técnicas “antisentido” inhibió la proliferación celular. Todos los tumores expresan RE alfa por WB sin determinar hasta ahora patrones de expresión en los distintos tumores. No se abordaron estudios de inmunohistoquímica para evaluar la presencia de receptores para glucocorticoides o de andrógenos. Los estudios de binding y de respuesta hormonal sugieren que no participarían en la proliferación celular.

Para evaluar la acción hormonal directa, se puso a punto una técnica para realizar cultivos primarios de una línea tumoral PD: C4-HD (42). Se obtuvieron cultivos enriquecidos de células epiteliales y de células estromales. Las células epiteliales se reinocularon en ratones BALB/c para evaluar la hormono-dependencia in vivo. Esta nueva línea se llamó CC4-HD y se observó un patrón de crecimiento similar entre las dos líneas tumorales. Pudimos demostrar que in vitro en las células epiteliales:
a) El MPA estimuló el crecimiento sólo de células epiteliales (citoqueratina positivas). La máxima proliferación se observó tratando a las células con MPA 10 nM (42).
b) Se obtuvo el mismo resultado tratando a las células con Pg (42).
c) El crecimiento celular se estimuló con concentraciones 100 veces mayores de DHT y dexametasona que de MPA (42).
d) E2 inhibió el crecimiento celular en concentraciones mayores de 0.1 nM (39;42).
e) Tanto E2 como los antiestrógenos tamoxifeno e ICI 182.780 y los antiprogestágenos RU 486 y ZK 299 inhibieron la proliferación celular inducida por MPA (39;42;43).
f) El raloxifeno por otra parte potenció la estimulación inducida por MPA (39).
g) De los factores de crecimiento ensayados: EGF, IGF 1, IGF II, aFGF, bFGF y TGFß1-3, sólo los FGFs indujeron efectos proliferativos en las células epiteliales mientras que los TGFßs fueron inhibitorios (38;43-45).h) Otros autores demostraron efectos proliferativos con Heregulina y TNF alpha (46).
i) Tratamiento con oligonucleótidos antisentido de RP y antiprogestágenos inhiben la proliferación celular inducida tanto por progestágenos como por FGFs sugiriendo un cross talk entre ambas vías proliferativas. Esta inhibición es específica de las células tumorales (43).
j) Tratamiento con oligonucleótidos antisentido de R-IGF 1 inhibe la proliferación celular (44) pero de manera no específica ya que el mismo efecto se observa en cultivos de fibroblastos estromales estimulados con factores de crecimiento como el EGF.

En cultivos de fibroblastos estromales se demostró que en condiciones experimentales de quiesencia, todos los factores de crecimiento mencionados anteriormente estimularon la proliferación celular. Por otro lado las hormonas esteroideas usadas o los antagonistas hormonales no afectaron la proliferación celular. Solamente el RU 486 ejerció pequeños efectos proliferativos, posiblemente por su efecto antiglucocorticoide. El co-cultivo de células epiteliales y fibroblastoides produce un incremento notable en la proliferación celular. Los mecanismos asociados a esta interacción se están estudiando actualmente. Por otra parte cuando suero obtenido de ratones ovariectomizados y tratados con MPA se utilizó en los experimentos en lugar de suero fetal bovino, demostramos que factores séricos inducidos por MPA estaban potenciando el efecto proliferativo por MPA, sugiriendo que este progestágeno puede actuar junto con otros factores o haciendo a las células más sensibles a el MPA (43).

Para completar un modelo experimental nos pareció de suma importancia desarrollar líneas celulares de nuestros tumores experimentales. En un principio el objetivo era tener líneas que se comportaran de manera similar a los cultivos primarios para poder manipular genes mediante transfecciones y otro tipo de herramientas moleculares. Hemos logrado desarrollar cinco líneas celulares a partir del tumor PD CC4-HD, llamadas MC4-L1 hasta MC4-L5 respectivamente y dos líneas derivadas del tumor PI respondedor C7-2-HI. Estas líneas representan las primeras desarrolladas en cáncer de mama murino que expresan receptores hormonales y por lo tanto pueden ser reguladas por hormonas. Cada línea presenta alguna particularidad. Pudimos observar que las líneas de morfología epitelioide son muy poco respondedoras in vitro a diferencia de las de morfología más fibroblastoide. Por otra parte in vivo el comportamiento es opuesto, las respondedoras in vitro no responden in vivo (30). Las líneas fibroblastoides son menos respondedoras al TGFß. Lo más llamativo resulta que los estrógenos, que eran las hormonas inhibitorias por excelencia, en nuestro modelo experimental estimulan el crecimiento in vitro. Los mecanismos de esta diferencia de respuesta no se conocen.

Desde el punto de vista global este modelo tiene la ventaja que permite el estudio de los procesos de carcinogénesis de la glándula mamaria. Estos experimentos llevan mucho tiempo y deben realizarse con un número grande de animales pero tienen la ventaja que se evalúa la aparición de un tumor en el contexto de un organismo “enfermo”. En este sentido cabe destacarse no sólo el efecto protector de la ovariectomía sino también el de la sialoadenectomía sobre la incidencia de carcinomas mamarios. El hecho de que los tumores son transplantables y progestágeno-dependientes pero que hayan dado origen a variantes hormono-independientes respondedoras o no al tratamiento hormonal permite por un lado el estudio de los mecanismos asociados a la respuesta proliferativa a hormonas y por otro lado el estudio de los mecanismos involucrados en la transición a la autonomía y resistencia hormonal. Este es uno de los pocos modelos in vivo para este tipo de estudios que son de suma importancia dado que es la problemática más importante no resuelta en cáncer de mama humano.
La posibilidad de contar con cultivos primarios de estroma de los distintos tumores permite el abordaje del estudio de las relaciones parénquima-estroma tumoral.
Por último, si bien el objetivo de desarrollar líneas celulares con la misma respuesta hormonal que los tumores originales no fue lograda ya que en las líneas celulares las respuestas son diferentes, por ejemplo son estimulables por E2, nos hace replantear cómo habrán sido los tumores de las pacientes cuyas líneas celulares establecidas también son estimulables por E2. Además las líneas son muy útiles para estudios de mecanismos particulares y se están usando, como por ejemplo por el Dr Benard de Canadá, para el desarrollo de técnicas de tomografía para detectar metástasis a distancia usando moléculas fluoresceinadas que se unen a receptores estrogénicos.
Como modelo de cáncer humano creemos que este modelo reúne las características más importantes del cáncer humano: histología ductal, capacidad metastásica, transición por distintos estadíos de hormono-dependencia, expresión de receptores hormonales, y respuesta al tamoxifeno.
Como enseñanza mayor nos deja la idea de que aún un tumor con p53 mutado (resultados no publicados) y sobre expresión de c-erbB2 (46), dos de los genes involucrados en cáncer de mama humano (y los únicos explorados) es capaz de desaparecer casi completamente si encontramos la llave apropiada, en este caso el receptor de progesterona. Por lo tanto el único camino plausible para controlar la enfermedad será el conocimiento de los mecanismos subyacentes en el control de la proliferación tisular.
Si se tiene en cuenta que recientemente dos estudios realizados en mujeres postmenopáusicas con terapia de reemplazo hormonal combinada revelaron un aumento de cáncer de mama en mujeres bajo tratamiento combinado con MPA, cuyos resultados muchos autores tienden a minimizar, algunos investigadores recomendaríamos la lectura del manual de la IARC de la última reunión científica en Lyon donde el MPA pasó de la categoría de no demostrada actividad carcinogénica a compuesto con demostrada actividad carcinogénica en animales de laboratorio (4).

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