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ANÁLISIS DEL PERFIL SECRETÓMICO DE TRAMETES VILLOSA LBM 018 DESARROLLADO EN CULTIVO LÍQUIDO OPTIMIZADO PARA LA PRODUCCIÓN DE LACASAS

SAWOSTJANIK AFANASIUK, Silvana Soledad | GONZALEZ HOLC, Victoria Guadalupe | DIAZ, Gabriela Verónica | ALVARENGA, Adriana Elizabet | ZAPATA, Pedro Darío

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR – INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA MISIONES – UNIVERSIDAD NACIONAL

Introducción y Objetivos:
En la actualidad existe un gran interés en los biocombustibles como alternativa a los combustibles tradicionales. Dentro de los cuales, el bioetanol de segunda generación cobra mayor interés ya que es producido a partir de residuos provenientes de agro-foresto-industrias. Sin embargo, la producción de bioetanol lignocelulósico requiere de una serie de tratamientos previos sobre la biomasa para la degradación de su componente más recalcitrante, la lignina, y para la obtención de azúcares fermentables. Estos pretratamientos encarecen los costos de producción ya que se realizan utilizando químicos y enzimas de alto costo. Los hongos de pudrición blanca presentan una amplia capacidad degradativa, produciendo como parte de su metabolismo un amplio espectro de enzimas oxidativas que actúan sobre la lignina. Es por ello que se planteó como objetivo de este trabajo analizar el perfil secretómico de Trametes villosa LBM018, un hongo nativo de Misiones, cultivado en medio líquido optimizado para la producción de enzimas lacasas.
Materiales y Métodos:
Primeramente se optimizaron las condiciones de cultivo del hongo, con el fin de obtener altas concentraciones de lacasas en sus sobrenadantes. Para ello se realizaron diseños experimentales que permitieron determinar las mejores condiciones físicas de cultivo, y la composición química del medio. Con los sobrenadantes obtenidos se determinó la actividad enzimática lacasa, que sirvió como estimación de la secreción de enzimas. Una vez lograda la optimización se realizaron cultivos del hongo en la condiciones optimizadas y cultivos controles. Los sobrenadantes obtenidos fueron utilizados para la identificación y análisis del secretoma por espectrometría de masas. Los sobrenadantes fueron filtrados y clarificados y las proteínas presentes en los mismos fueron reducidas, alquiladas, precipitadas y luego digeridas con tripsina. Los péptidos obtenidos fueron separados y analizados por nanoHPLC acoplado a un espectrómetro de masa con tecnología Orbitrap. Los datos obtenidos fueron analizados con el programa Proteome Discoverer.
Resultados:
Por medio de la optimización se logró incrementar la actividad enzimática lacasa 700%, el análisis de secretoma permitió corroborar que este aumento en actividad se debe a un aumento en la secreción de enzimas lacasas, siendo en los controles la abundancia relativa de 7% y en el optimizado 32%. Además se incrementaron otras oxidorreductasas, como las peroxidasas, siendo de 3% en los controles y 22% en el optimizado.
Conclusiones:
Se concluye que gracias a la optimización de las condiciones de cultivo de hongos de pudrición blanca, se pueden generar sobrenadantes optimizados en enzimas particulares que puedan ser aplicados sobre residuos lignocelulósicos para producir bioetanol disminuyendo costos en el proceso. Los análisis del secretoma permiten identificar las enzimas secretadas, generando herramientas para diseñar la forma de aplicación adecuada.