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ESCHERICHIA COLI ENTEROHEMORRÁGICA (EHEC): ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN Y FUNCIONALIDAD DEL SISTEMA DE SECRECIÓN TIPO III

LABORATORIO DE PATOGÉNESIS E INMUNOLOGÍA DE PROCESOS INFECCIOSOS, IMEX-CONICET-ANM 1; DIVISION OF INFECTION AND IMMUNITY, THE ROSLIN INSTITUTE, UNIVERSITY OF EDINBURGH. 2

Introducción y Objetivos:
Los genes para las toxinas Shigas (Stx) están codificados en bacteriófagos lamboides que lisogenizan a las Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC), constituyendo un factor determinante en el desarrollo del Síndrome Urémico Hemolítico; sin embargo, la capacidad para la formación de lesiones características de attaching and effacement (A/E) en el epitelio intestinal, debido a la actividad del Sistema de Secreción Tipo III (T3S), establece un factor esencial en la adherencia y colonización de EHEC. El T3S se expresa desde la isla de patogenicidad Locus of enterocyte effacement (LEE), en donde el regulador Ler, codificado en el primer operon controla la transcripción de los demás operones (LEE2-5). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto que tiene in vitro e in vivo la sobreexpresión del regulador Ler del T3S en cepas EHEC.
Materiales y Métodos:
Transformamos con un plásmido que codifica para el regulador interno del LEE (Ler) dos cepas EHEC una productora de Stx2, aislada en humanos (125pLer) y su isogénica mutante que no expresa Stx2 (ΔStx pLer). Como control usamos el mismo plásmido sin la secuencia de Ler (125pW y ΔStx pW). Analizamos la expresión de proteínas del T3S mediante SDS-PAGE y Western blot (Esp B/D), la adhesión bacteriana in vitro a células epiteliales intestinales (HCT-8 y Caco-2), la colonización bacteriana in vivo en un modelo murino de SUH por inoculación intragástrica de las cepas clonadas y la motilidad mediante pruebas microbiológicas.
Resultados:
Observamos un aumento en la expresión de Esp B/D en 125pLer y ΔStx pLer por SDS-PAGE y WB, además 125pLer mostró mayor adhesión a células HCT-8 y Caco-2 con respecto a las demás cepas, evidenciado también por microscopia confocal (% de adherencia±DS: HCT-8 = 125pLer: 69±2; 125pW: 20±3; ΔStx pLer: 35±1; ΔStx Pw: 15±1; Caco-2 = 125pLer: 49±1; 125pW: 10±1; ΔStx pLer: 36±4; ΔStx Pw: 12±1; ANOVA p˂0.05). Así mismo, se encontraron diferencias en la colonización entre las cepas en Materia fecal (MF) log UFC/g y en Intestino Grueso (IG), Intestino Delgado (ID) y Ciego (C) log UFC/cm (Media±ESM) 125pLer MF: 3,3±0,4 IG: 3,7±0,3 ID: 4,2±0,3 C: 3,9±0,4; 125pW: MF: 2,3±0,4 IG: 3,2±0,3 ID: 4,3±0,3 C: 3,0±0,4; ΔStx pLer: MF: 3,7±0,3 IG: 3,7±0,4 ID: 3,5±0,6 C: 3,3±0,7; ΔStx Pw: MF: 2,1±0,4 IG: 2,7±0,5 ID: 2,9±0,5 C: 3,3±0,7; ANOVA p0.012). Igualmente se vio que 125pLer produjo mayor mortalidad en un modelo murino (% de mortalidad: 125pLer: 100; 125Pw:60 Log-rank p<0.05). Las pruebas de motilidad mostraron mayor diámetro (mm) a las 48 hs en las cepas que no tenían sobreexpresión de Ler (media±ESM: 125pLer: 34±6; 125pW: 45±8; ANOVA p˂0.05; ΔStx pLer: 37±8; ΔStx Pw: 80±3; ANOVA p˂0.05).
Conclusiones:
La sobreexpresión de Ler favorece el aumento de la producción de proteínas del T3S que, por un lado, lleva a una disminución en la motilidad y, por otro lado, a una mayor adhesión bacteriana y colonización intestinal. Todas estas observaciones en conjunto determinan un aumento en la patogenicidad in vivo.