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REGULACIÓN DE LA SÍNTESIS DE LÍPIDOS EN BACTERIAS GRAM-POSITIVAS

MACHINANDIARENA, Federico | DE MENDOZA, Diego | ALBANESI, Daniela

INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE ROSARIO (IBR-CONICET, FBIOYF, UNR)

Introducción y Objetivos:
Las bacterias controlan estrictamente la síntesis de los fosfolípidos de membrana, pero aún se desconocen en detalle los mecanismos regulatorios subyacentes. En Bacillus subtilis, paradigma de las bacterias Gram-positivas, los ácidos grasos (AG) son producidos por la sintetasa tipo II (FASII) que consiste en un ciclo de reacciones repetitivas. En la FASII, las cadenas de acilo intermediarias son transferidas de una enzima a la otra unidas covalentemente a la proteína transportadora de acilos (ACP). El malonil-CoA, sintetizado por la enzima acetil-CoA carboxilasa (ACC), es un intermediario clave de la biosíntesis de AG en todos los organismos vivos. Cuando los acil-ACPs alcanzan el largo adecuado son utilizados como sustrato por las enzimas responsables de la síntesis de fosfolípidos (SFL): PlsX (acil-ACP:PO4 aciltransferasa), PlsY (acil- PO4:glicerol-PO4 aciltransferasa) y PlsC (acil-ACP:1-acilglicerol-PO4 aciltransferasa). En nuestro laboratorio, se demostró que en B. subtilis la FASII y la SFL están acopladas en el paso catalizado por PlsX. En ausencia de esta enzima tanto la SFL como la biosíntesis de AG se detienen. Es por eso que en este trabajo nos planteamos investigar el mecanismo implicado en este acoplamiento.
Materiales y Métodos:
Con este fin, utilizamos una cepa mutante de B. subtilis que expresa al gen plsX en forma condicional. Se extrajeron y analizaron las distintas especies de CoA en presencia y ausencia de PlsX por HPLC-MS/MS de triple cuadrupolo. A su vez, investigamos el estado de acilación de la ACP en ambos casos mediante electroforesis en geles de poliacrilamida conformacionales y posterior western blot, utilizando anticuerpos policlonales anti-ACP de B. subtilis. Finalmente, estudiamos la biosíntesis lipídica en la mencionada mutante mediante el marcado de los cultivos con [14C]-acetato en presencia y ausencia de una tioesterasa soluble („TesA) que hidroliza los acil-ACPs.
Resultados:
Determinamos que en ausencia de PlsX B. subtilis acumula acil-ACPs de cadena larga, los que han sido propuestos en la literatura como inhibidores de retroalimentación negativa de la FASII. Llamativamente, detectamos que en ausencia de PlsX también se acumula malonil-CoA. A su vez, observamos que la hidrólisis de los acil-ACPs al expresar „TesA no libera completamente la inhibición de la síntesis de AG en ausencia de PlsX. Por otro lado, determinamos que las mutantes en las otras dos enzimas involucradas en la síntesis de fosfolípidos, PlsY y PlsC también acumulan acil-ACPs de cadena larga, mientras la síntesis de AG continúa activa.
Conclusiones:
Podemos concluir que en B. subtilis: i) la inhibición de la síntesis de fosfolípidos debido a la ausencia de PlsX provoca la acumulación de acil-ACPs de cadena larga, ii) la inhibición de la síntesis de AG observada en ausencia de PlsX no se debe a una represión de la actividad de la ACC, como se había sugerido y iii) los acil-ACPs de cadena larga no serían inhibidores por retroalimentación negativa de la ACC ni de la FASII.