RIVIERE, Nahuel | MARQUES DA SILVA, Wanderson | CATALDI, Angel | LARZABAL, Mariano
IABIMO INTA-CONICET; CICVYA, INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Introducción y Objetivos:
El sistema de secreción de tipo VI (SST6) se ha propagado ampliamente en bacterias Gram negativas como Escherichia coli enterohemorrágico (EHEC) O157:H7. Este sistema de secreción atraviesa la doble membrana bacteriana permitiendo que los factores de virulencia sean translocados directamente desde el citoplasma de la bacteria hacia la célula blanco. El SST6 posee 13 componentes esenciales conservados, entre ellos se encuentra la proteína TssB (componente de la cola retráctil). Durante la infección, EHEC O157:H7 coloniza regiones intestinales asociadas a los folículos donde se encuentran componentes del sistema inmune innato, principalmente macrófagos. Estos macrófagos fagocitan las bacterias EHEC O157:H7 adheridas al epitelio e inducen la producción y liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) para eliminarlas. Estudios recientes demostraron que EHEC es capaz de sobrevivir y de replicar dentro de los macrófagos luego 24 hs de ser fagocitado. Se estableció como objetivo evaluar si el SST6 de la cepa EHEC O157:H7 permite la supervivencia intracelular en macrófagos murinos.
Materiales y Métodos:
Se obtuvo una cepa EHEC O157:H7 mutante para el gen tssB por la metodología de CRISPR/Cas9. Se realizaron ensayos de supervivencia infectando monocapas de macrófagos murinos (RAW264.7) con las cepas EHEC O157:H7 salvaje y delta tssB (MOI 100). Luego de 30 minutos de infección, los macrófagos fueron lavados tres veces con PBS y posteriormente fue agregado medio DMEM fresco conteniendo 100 μg/ml del antibiótico gentamicina para eliminar las bacterias no fagocitadas. La placa se incubó durante 24 hs a 37°C en una atmosfera de 5% de CO2. Luego los macrófagos fueron lisados con una solución de SDS al 0.025% para liberar las bacterias internalizadas. Se realizaron diluciones seriadas para los diferentes tiempos postinfección (2 y 24 hs) y fueron plaqueadas en LB agar donde se cuantificaron las bacterias fagocitadas viables. El ensayo fue realizado por triplicado.
Resultados:
Mediante la técnica de CRISPR/Cas9 se obtuvo una cepa EHEC O157:H7 mutante para el gen tssB. La cepa EHEC O157:H7 delta tssB fue evaluada en ensayos de sobrevida en macrófagos. Se pudo demostrar que no hay diferencias significativas entre la cantidad inicial de bacteria salvaje y mutante del SST6 fagocitadas a las 2 hs de incubación. Sin embargo, se observó una diferencia significativa al cuantificar un 86 % menos de sobrevida de bacterias mutantes para el SST6 luego de 24 hs de incubación en comparación con la cepa salvaje.
Conclusiones:
La obtención de la cepa EHEC O157:H7 defectiva para el SST6 nos permitió evaluar la relación entre dicho sistema de secreción y la sobrevida de la bacteria en macrófagos. La cepa EHEC O157:H7 delta tssB demostró una menor sobrevida al ser fagocitada por macrófagos. Estos resultados sugieren que la sobrevida de EHEC O157:H7 en el macrófago es dependiente de un SST6 funcional
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Revista QuímicaViva Número 3, año 18, Diciembre 2019 quimicaviva@qb.fcen.uba.ar |
