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Revista
QuímicaViva Número 3, año 3, septiembre 2004 quimicaviva@qb.fcen.uba.ar |
“Del vuelo de las proteínas y de cómo lograrlo”
(Espectrometría de masa ESI)
Rosa Erra-Balsells
CIHIDECAR-CONICET, Departamento de
Química Orgánica,
Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, UBA
Recibido 16 de agosto de 2004/
Aceptado 30 de agosto de 2004
Resumen
El método “electrospray” (ESI-MS) ha
extendido el uso de la La espectrometría de masa con ionización. La una gran
variedad de compuestos que incluyen proteínas, glicoproteínas, oligosacáridos,
nucleótidos (ADN, ARN y oligonucleótidos), fullerenos, polímeros sintéticos,
compuestos inorgánicos y organometálicos entre otras especies termolábiles. Sin
embargo, lo que distingue fundamentalmente a este método de ionización
extremadamente suave del denominado UV-MALDI es la producción preferencial de
iones gaseosos policargados y la posibilidad de su generación a partir de
macromoléculas biológicas termolábiles donde la presencia de interacciones
nativas no covalentes permanece inalterada. Esta caraterística es la base de su
uso para estudiar desde el punto de vista estructural, cinético y termodinámico
interacciones entre biomoléculas del tipo complejos proteína-proteína, complejos
enzima-inhibidor, o interacciones del tipo centro activo proteico-fármaco o
ADN-fármaco. El proceso de plegado y desplegado de proteínas también se puede
estudiar con esta técnica. Estas aplicaciones especiales sumado al hecho
de que constituye la interfase entre técnicas separativas en fase líquidas (LC,
HPLC, HPCE, SEC, IEC) y la espectrometría de masa, son los factores que han
contribuído al uso atractivo de la ESI-MS en áreas tan diversas como
biotecnología, bioanalítica, biología molecular, química medicinal y
farmacéutica y nuevos materiales incluyendo organometales y polímeros
sintéticos.
Palabras clave: ionización "electrospray", ESI,
proteómica, complejos no-covalentes; complejos proteicos
Electrospray
ionization mass spectrometry (ESI-MS) has made MS a viable analytical technique
to study a wide range of thermally labile compounds including proteins and
glycoproteins, nucleotides (including DNA, RNA, and oligonulcleotides),
fullerenes, synthetic polymers, inorganic and inorganic organometallic
compounds. The basic difference between soft ionization methods as UV-MALDI and
ESI is that the latter provides an inherently “gentle” ionization that has been
shown to produce intact multi charged iones from thermally labile biological
molecules even biologically relevant native noncovalent complexes. This latter
capability provides the basis for studying structurally, cinetically and
thermodinamically point of view specific biomolecular interactions, including
protein-protein complex, enzyme-inhibitor interactions, active hole protein-drug
interactions and DNA-drug interactions. Folding and unfolding protein process is
also studied. These attractive features together with the fact that ESI-MS can
be hyphenated to analytical chromatography methods dealing with liquid solutions
(LC, HPLC, HPCE, SEC, IEC, etc.) have made electrospray ionization a topic of
intense research activiy in recent years and has resulted in rapid acceptance
and use in the biotechnology, bioanalytical, molecular biology, medicinal
chemistry, pharmaceutical, new materials as organometallic and sinthetic
polymers research communities.
Key
words:
electrospray ionization, ESI, proteomics, non-covalent complex, protein-protein
complex.
Introducción
Desde la década del 90 la
espectrometría de masa (MS) se ha transformado en una técnica analítica
indispensable en el campo de la química biológica. En términos generales permite
hacer determinaciones estructurales, identificaciones y análisis de trazas. Es
en la actualidad una alternativa muy atractiva que reemplaza a la utilísima
secuenciación de Edman de polipéptidos y a métodos clásicos usados para la
identificación de modificaciones post-transduccionales. Permite, además,
estudiar interacciones de tipo no covalentes, por ej. estudios de la unión
antígeno-anticuerpo que permiten identificar los ligandos específicos a
determinados receptores. La combinación de la MS con la electroforesis
bidimensional (2-D GE) y las técnicas analíticas separativas líquidas (LC, HPLC,
HPEC, SEC, IEC) permite identificar proteínas. La miniaturización de la escala
de trabajo al nano-litro y al nano-flujo han optimizado las características de
esta técnica en lo que se refiere a tiempo y sensibilidad.
Toda esta revolución se debe a que a
fines de la década del 80 se introdujeron dos métodos suaves para la
volatilización / ionización de moleculas termolábiles. En la actualidad podemos
decir que estos métodos de ionización, ESI y UV-MALDI [1], son complementarios
(Fig.
1). El primero requiere
disponer del analito en solución, en un medio polar, introducido en forma de
flujo continuo a la región donde se aplica un elevado campo eléctrico. El
segundo requiere disponer del analito sólido mezclado con un fotosensibilizador
(matriz) depositado sobre el electrodo al que se aplicará un campo eléctrico
luego de haber sido bombardeado por un láser UV [1]. Ambos son suficientemente
suaves, de manera que generan iones moleculares gaseosos intactos. El primero
genera para un dado analito de peso molecular m, una familia de iones
moleculares gaseosos policargados (m/z; m, peso molecular; z, carga; z=1, 2,
3,…,n; m/1, m/2, …….m/n) mientras que el segundo genera preferentemente el ión
molecular gaseoso monocargado (m/z; z=1; m/1).
Figura 1. MS de macromoléculas. En
ESI-MS se generan varios iones a partir del ión molecular (m), de
diferente m/z, con 4 < z <8. A partir de ellos se calcula el valor
de m (peso molecular) (superior). En UV-MALDI se genera el ión molecular
monocargado (z=1), pequeñas proporciones del ión doblemente cargado (m/2),
y del dímero (2m/1).
El sueño se hizo realidad...”Las
macromoléculas vuelan porque ESI da alas a moléculas elefánticas”
Como se detalla en el artículo
precedente [1], uno de los desafios en la década de los 80 era encontrar la
forma de analizar compuestos de alto peso molecular, termolábiles por
espectrometría de masa, y además, convertir a esta técnica en el detector de las
técnicas analíticas separativas en fase líquida (técnicas cromatográfícas para
analitos en solución líquida; LC, HPLC, HPEC, SEC, IEC) [2]. La introducción de
la técnica de ionización basada en la generación, a partir de la solución del
analito, de una nube (“spray”) formada por diminutas gotas cargadas
eléctricamente, que es sometida a la acción de una fuerte campo eléctrico,
convirtió ese ansiado sueño analítico en realidad [2]. A este método de
ionización se lo llamó “electrospray” (ES) y las diferentes mejoras tecnológicas
han conducido al método de ionización que hoy conocemos como “electrospray
ionization” (ESI) y que llevó a John B. Fenn [3] a compartir
con el Ing. Tanaka el Premio Nobel
de Química 2002 [1]. Se trata del método de volatilización / ionización de
analitos más suave que se conoce a tal punto, que se ha demostrado que material
viral sometido a este método de ionización mantiene intacta su actividad luego
de ser sometido a tal proceso [4].
Como dijo Fenn: “Las
macromoléculas vuelan porque ESI da alas a moléculas elefánticas” (Fig. 2) [3].
Un poco de historia acerca del
desarrollo del método de ionización ESI
A la descripción de los experimentos
iniciales efectuados por el físico John Zeleny en 1917 siguió la primera
explicación lógica del fenómeno de la generación de una nube con microgotas
cargadas efectuada por Malcolm Dole recién en 1968 [5]. Esta descripción del
principio por el que se produce el "electrospray" (ES) y su comportamiento bajo
la acción de un fuerta campo eléctrico, incluye el modelo que contempla la
formación de cargas residuales (CRM) el que ha sobrevivido como la mejor
descripción física del enigmático proceso de ioniación por "electrospray" (ESI)
(Fig.
3). De acuerdo a este
modelo, las microgotas cargadas electrostáticamente sometidas a un fuerte campo
eléctrico, sufren primero una contracción de volúmen y sus componentes pasan al
estado gaseoso, cuando el número de cargas electrostáticas del mismo signo, que
se encuentran en la superficie, es mayor que las que puede estabilizar una gota
del mismo tamaño teniendo en cuenta las repulsiones de Coulomb. En ese momento,
se produce la “explosión de Raleigh” que no es más que la eyección de moléculas
de la superficie de la gota que pasan al estado gaseoso llevándose una o varias
cargas, con el objeto de disminuir el número de cargas y las fuerzas repulsivas
en la superficie. Esta “explosión” origina a una microgota cargada de tamaño
menor, la cual sigue teniendo en su superficie un número alto de cargas
electrotáticas del mismo signo. Ésta bajo la acción del fuerte campo eléctrico
vuelve a contraerse. Si en esta gota menor no se cumple de nuevo la relación
número de cargas repulsivas a superficie total de la gota adecuada, vuelve a
producirse una “explosión de Raleigh”, con pasaje al estado gaseoso de más
moléculas mono o policargadas componentes de la gota. Esta sucesión de
contracciones-explosiones (evaporaciones superficiales) – disminución del tamaño
de la gota –contracciones- explosiones (evaporaciones superficiales) – etc., va
generando moléculas gaseosas ionizadas de los componentes de la gota orignal y
por lo tanto, de la solución de partida (Fig.
3). Las fuerzas repulsivas que provocan estas explosiones no inducen en
general la ruptura de uniones químicas. Por lo tanto, es posible generar, a
partir de soluciones diluídas, iones moleculares gaseosos intactos de cualquier
analito presente en la solución. La particularidad de este método de
volatilización / ionización no es solamente su “suavidad” (producción del ión
molecular intacto) sino además la generación de una familia de iones debido a
que el ión molecular intacto puede alojar un número variable de cargas (ion
molecular policargado; m/z, para un dado m, z, familia de número de cargas; z=
1, 2, 3,…..n).
La mayor o menor capacidad que
tendrá el analito para generar moléculas gaseosas cargadas y el número de cargas
(z), depende directamente del peso molecular (m) y del carácter polar del mismo,
o sea de su estructura química (tipo y número de grupos funcionales polares
presentes). A mayor peso molecular y mayor número de grupos polares, mayor
posibilidad de generar iones policargados (z>1) y menor posibilidad de
generar iones monocargados (z=1). Además, la mayor o menor capacidad que tendrá
el analito para generar iones gaseosos cargados positivamente (cationes) o
negativamente (aniones) depende en primer lugar del tipo de grupos polares
presentes en su estructura y en segundo lugar de las características del medio
(pH, presencia de sales) y del solvente de la solución original (caracter
prótico del solvente, polaridad, constante dieleléctrica, etc.).
Esta triple dependencia (estructura
molecular-medio-solvente) del proceso de ionización llamado ES y su suavidad,
indica por un lado el campo de aplicación del mismo el cual si bien en principio
parecería limitarse al ámbito de las moléculas polares en medios polares se
extiende al de las moléculas polarizables mediante modificaciones adecuadas del
medio donde se las disuelve (cambio de pH, agregado de sales cuyos cationes
forman complejos gaseoso estables cargados con la molécula del analito neutro,
etc.).
Cabe señalar que, dependiendo de los
factores antes mencionados, para un analito M su ionización en modo positivo
puede deberse a la fijación de (i) n protones: [M(H)n]n+, (ii) m ó p cationes
(Na+, K+, Li+, Cs+, etc.): [M(Na)m]m+ , [M(K)p]p+ , etc., (iii) la combinación
de n protones y m y p cationes: [M(H)n]n+ , [M(H)n(Na)m](n+m)+ ,
[M(H)n(Na)m(K)p](n+m+p)+, [M(H)n(K)p](n+p)+ , [M(Na)m]m+, [M(K)p]p+ , [M(Na)m
(K)p](m+p)+, etc. donde todas las combinaciones y valores de n, m y p son
posibles. En modo negativo normalmente se produce la pérdida de protones
[M-(H)n]n- y/o la pérdida de cationes en compuestos salinos: ej. para un
compuesto M, de estructura M = N-(SO4Na)m, pueden formarse la familia de aniones
{[N-(SO4Na)m]-nNa}n- con m ³ n. Esta complicación adicional en
cuanto a que los iones policargados múltiples que se pueden formar dependen no
sólo de la estructura del analito sino además de los componentes de la solución
(pH, sales) son una fuerte desventaja del método de ionización ESI frente al
método de ionización suave UV-MALDI. La pureza del analito y de la solución es
crítica en el primero (Fig. 4) (Tabla 1).
Tabla 1. ESI-MS y UV-MALDI-MS:
características, utilidad, ventajas, desventajas y campo de
aplicación.
Método
de ionización |
Límite pm
teórico/Da (práctico/Da) |
Rango dinámico
m/z medible teórico/Da (práctico/Da) |
Ventajas |
Desventajas |
Campo
de aplicación |
UV-MALDI |
>300000
(~
200000) |
23-
>300000 (23-200000) |
-Ión único
(m/z, m=pm; z=1) en modos (+) y
(-). -Bajo efecto de sales
(~
mM). -Análisis de mezclas (ej.:
huella peptídica; oligómeros). -MSn (fragmentación)
estructura del compuestos: ej. secuenciación de
proteínas. -Sensibilidad:
fmol-atmol. |
-Interferencia de
la matriz. - No útil como detector ifenado
a métodos separativos (GC/GCL/LC/HPLC/HPCE). -Analítica s/muestra
sólida. -No útil para compuestos que
absorben a la lem del Laser. -Falta de reglas para selección
de la matriz adecuada. |
-Péptidos -Proteínas -Glicoproteínas -Hidratos de
carbono -Glicoconjugados -Nucleótidos -Nuclósidos -Esfingolípidos -Lípidos -Polímeros sintéticos polares y
no polares -Moléculas polares
pequeñas |
ESI |
~
200000 (70000) |
23~10000 (23~4000) |
-Familia de iones
(m/z, m=pm; z = 1, 2, 3,..,n) en modos (+) y
(-). -Suave: no rompe interacciones
débiles no covalentes (ej, complejos proteicos;
organometales). -MSn (fragmentación)
estructura del compuestos: ej. secuenciaci”on de
proteínas. -Sensibilidad:
fmol-atmol. -Analítica sobre muestra en
solución. -Gran utilidad como detector
ifenado a métodos separativos (LC; HPLC; HPCE; SEC;
IEC) |
-Analitos
puros. -Familia de iones moleculares
policargados confunde el análisis de mezclas. -No útil para
mezclas. -Interferencia de
sales. -Sólo para analitos polares y/o
polarizables. -Sólo solventes
polares. -Mantenimiento: frecuente por
contaminaciónde la cámara de ionización. |
-Péptidos -Proteínas -Glicoproteínas -Hidratos de
carbono -Glicoconjugados -Nucleótidos -Nuclósidos -Esfingolípidos -Organometales -Inorgánicos -Polímeros sintéticos polares y
polarizables -Moléculas polares pequeñas.
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En los experimentos que describió
Dole en 1968 [5] usó un gas inerte adicional para facilitar la
desolvatación irreversible (separación irreversible de moléculas del analito y
del solvente en el estado) gaseosodurante la “explosión de Raleigh”. En otros
experimentos se mejoraba la eficiencia de la generación de moléculas gaseosas
cargadas del analito en cuestión completamente ‘desorbidas” o libres de
moléculas de solvente, calentando el conducto o aguja metálica o “tip”
(Fig. 3) por el que circula la solución que
va a ser volatilizada / ionizada por ES y al que se aplica un alto voltaje. Esta
es la denominada “thermo spray ionization” (TES) [2,3] que es la base de la
“atmospheric pressure chemical ionization” (APCI) [2].
Pero…si la técnica de ionización de
moléculas por nebulización llamada ES se conocía desde la década del 60, ¿porqué
recibe John B. Fenn el Premio Nobel en el año 2002? ¿Cúal ha sido su
contribución?
Lo que conocemos hoy como método de
volatilización / ionización ESI de real utilidad para moléculas termolábiles es
una modificación del método de Dole, que Fenn presenta en un simposio en San
Francisco (USA) en 1988 (Fig. 5) [6]. En dicha comunicación se
describió la identificación de polipéptidos y proteínas de peso molecular 40
kDa. Fenn demostró que era posible determinar, a partir de la familia de iones
generada debido a la policarga de un mismo ión molecular m, su peso molecular
con una exactitud del 0,01%. Para ello, teniendo en cuenta la abundancia
isotópica natural de cada elemento constituyente, se simulaba matemáticamente
cúal era la mejor combinación de átomos en el ión molecular (el mejor m) que
generaría la familia de iones multicargados obtenida en cada caso
experimentalmente. Este resultado fue la culminación de desarrollos tecnológicos
y de modelado matemático que se venían haciendo en el laboratorio de Fenn, en
Yale, desde 1984 [7]. En ese año se efectuó exitosamente la utilización del
"electrospray" como método de volatilización / ionización en un espectrómetro de
masa. Fenn usó su conocimiento sobre el proceso denominado “free-jet expansion”
en la interfase líquido-gas ionizado, y en cooperación con el especialista
japonés en "jets" profesor Yamashita, modificó el arreglo experimental del ES
descripto por Dole [5]. Entre otras cosas se agregó un gas inerte adicional para
optimizar el proceso de desolvatación (“drying gas”), eliminando el proceso
inverso o re-solvatación del ión gaseoso macromolecular formado, sin necesidad
de calentar el “tip” o “needle” metálico y la cámara de ionización y/o la
solución de analito que se introduce en flujo a través del “tip” (“needle”)
(Fig
5).
Por un lado eliminó el calentamiento
que induce la descomposición de moléculas termolábiles. En segundo lugar
modificó la forma de colectar y analizar a los iones producidos. En reemplazo de
la caja de Faraday conectada al galvanómetro de Dole [3, 5-7], luego de colectar
y obligar a pasar el haz de iones por un “primer agujero colector” (nozzle), y
en segundo lugar “a través de una espumadera o separador de partículas sólidas”
(skimmer) que terminaba de separar las moléculas gaseosas de aquéllas que pasan
al estado sólido, introdujo a la corriente de moléculas gaseosas policargadas en
un “quadruopolo” (Fig. 5). En esa época el “quadrupolo” ya se
usaba exitosamente como un analizador de iones de muy buena resolución para
rangos de m/z < 2000 Da. Se conocían muy bien su usos como filtro de iones y
como elemento focalizador de haces de iones (Figs. 5 y 6) [2,3].
En forma casi simultánea, el grupo
liderado por el profesor Aleksandrov en Rusia efectuó una mejora muy similar al
ya conocido método de Dole, con el mismo objeto de mejorar la generación de
moléculas gaseosas iónicas a partir de soluciones de analitos termolábiles [8].
Como se muestra en la Fig. 6, la cámara de ionización ESI consta
siempre de dos partes: (i) la cámara de nebulización y (ii) la zona de enfoque
de iones. La primera se encuentra a presión atmosférica la segunda con vacío
intermedio (10-2-10-4 Tor). En la primera al “tip” se le aplica alto voltaje
(2-4 kV), en la segunda siempre están presentes “nozzle”, “skimmers” y
“quadrupolo”. Según sea el signo del voltaje aplicado en el “tip” y en el
“nozzle’ se analizan cationes (modo positivo) o se analizan aniones (modo
negativo).
Acerca de proceso
ESI
El proceso ESI está gobernado por
una serie de parámetros química y físicos cuya optimización en forma conjunta
determina la eficiencia del proceso. El proceso en su conjunto, del principio al
final, puede representarse como un circuito eléctrico que genera y controla la
nube (spray) de gotitas líquidas cargadas (Fig. 1). El proceso se inicia con el
analito generalmente cargado (protonado) y disuelto en un medio con alto
contenido acuoso (solvente polar). Al final del proceso el mismo analito como
una molécula gaseosa multicargada y desnuda (desolvatada, no interactuado con el
solvente) es atraída y colectada por el orificio de entrada del analizador de
masas (nozzle) (Figs 1, 5 y 6). En el alto vacío del analizador
(Fig.
6), el analito gaseoso
policargado será selectivamente caracterizado por su relación m/z, quedando
totalmente en el olvido el hecho de que se trate de un analito de alto peso
molecular y termolábil.
Siguiendo con el proceso
representado en las Figs. 1 y
3, las pequeñas gotitas
inicialmente formadas tienen carga positiva o negativa, dependiendo de la
polaridad asignada a la punta metálica del conducto inyector de la solución
(electrodo madre del circuito; “tip”). El conjunto de moléculas protonadas o
unidas a cationes metálicos (cationes) o deprotonadas (aniones) gaseosas quedan
totalmente libres de solvente luego que éste se evapora. Como se muestra en la
Fig. 4 en el caso de formarse especies protonadas, el número de cargas es igual
al número de protones fijados a los grupos accesibles protonables. Según sea la
naturaleza química y el peso molecular del analito, el número z puede variar
entre 2 y 40 o ser aún mayor. Si el analito es una especie química única, el
espectro resultante mostrará una serie regular de señales que reflejan los
diferentes valores de m/z (Fig. 1). El hecho de que se generen
familias de señales agrega complejidad a la interpretación de los espectros de
masa obtenidos e inicialmente fue un factor de confusión que generaba rechazo en
los posibles usuarios.
Había que pasar desde la imagen
clásica de los espetros de masa obtenidos mediante otras técnicas de ionización,
donde predominan los iones moleculares monocargados a las nuevas imágenes donde
cada ión molecular intacto puede generar una familia de iones moleculares
intactos policargados.
Sin embargo, se debe a Fenn no
solamente el desarrollo tecnológico que optimizó el proceso “free-jet expansion”
(y como consecuencia la eficiencia de la volatilización / ionización sin
necesidad de calentar el sistema), sino que, además, fue él quién desarrolló los
primeros programas de cálculo. Los que mostraron que la complejidad debida a las
múltiples señales obtenidas por cada ión molecular, agregaba información para un
cálculo más exacto del peso molecular del ión molecular intacto monocargado no
detectado (valor de m). Este “secreto” fue revelado por Fenn como la “teoría de
la carga múltiple” en una publicación del año 1987 [9]. Esta teoría demostró que
los diferentes estados cargados del mismo ión molecular podían intrepretarse
como medidas independientes del peso molecular del mismo analito y que, por lo
tanto, un método de promediación basado en la solución simultánea de una familia
de ecuaciones podría proveer una estimación mucho más precisa del peso molecular
de macromoléculas.
Como se ve en la Fig. 1, la proteína de peso molecular
47.342 Da es analizada por ESI-MS. El espectro de masa resultante mostró 50
picos debidos a 50 valores diferentes de z (50 cargas diferentes). Las señales
resultantes aparecen en la región de m/z 1-2000 Da y pueden ser analizadas muy
fácilmente en cualquier analizador de masas. Este conjunto de datos por
resolución del sistema de ecuaciones lleva a calcular un peso molecular
muchísimo más exacto que el que se obtendría a partir de un solo ión.
Cabe señalar además, que otra de las
ventajas del método de ionización ESI es que es el método de ionización de uso
actual en espectrometría de masa menos invasivo y modificante de las propiedades
del analito, salvo en lo que refiere a su volatilización y ionización. Por dicha
razón es posible estudiar complejos moleculares debidos a débiles interacciones
no-covalentes nativas tales como, por ejemplo: complejos proteína-proteína,
enzima-substrato o proteína-ligando (Tablas 1 - 2).
Con la técnica ESI no solamente
queda salvado el problema de la termolabilidad sino que además queda
tecnológicamente resuelto el problema de volatilizar / ionizar analitos
manipulando directamente la solución líquida que los contiene.
El uso de la espectrometría de masa
como detector de alta sensibilidad y resolución de técnicas cromatográficas en
fase líquida (LC) pasó a ser una realidad (Tabla 1).
ESI vs nano-ESI vs
Z-ESI
Ya el mismo Fenn, en sus primeros
trabajos, mostró también que la sensibilidad del proceso no se incrementaba
aumentando la concentración del analito en la muestra en flujo introducida al
sistema. Por el contrario, si el flujo variaba su velocidad de microlito/min a
nanolitro/min la sensibilidad del experimento aumentaba en varios órdenes
[10-11]. Se puede alcanzar sensibilidad a nivel del átomo-mol simplemente
disponiendo de un “tip” de diámetro menor y disminuyendo el flujo de
introducción de muestra y ésta es la diferencia entre la técnica denominada ESI
y nano-ESI; la primera trabaja con un flujo de microlitro/min y la segunda de
nanolitro/min. Además, cuando se trabaja con el “tip” nano-ESI, éste se lo
acerca más al “nozzle” y como consecuencia toda la nube entra a la región de
focalización, aumentándose la sensibilidad del método. Mayor sensibilidad y
requerimientos 1000 veces menores de muestra !!! (Fig. 7).
Una modificación tecnológica
posterior, denominda Z-ESI, tiene por objeto disminuir el número de partículas
sólidas que llegan al “quadrupolo” ubicado en la región de enfoque de iones
(Fig.
6). Estas partículas se
forman durante la nebulización siendo una de las
causas la presencia de sales en la
solución. Como se muestra en la Fig. 8 mediante un arreglo ortogonal del
primer electrodo orientador (electrodo 1) y el primer “skimmer” se desvía una
parte de la nube iónica inicial y se la redirecciona mediante un segundo
“skimmer” de manera de introducirla al “quadrupolo” de enfoque. En la actualidad
existen tanto cámaras de ionización Z-ESI (sinónimo de trabajo a escala del
microlitro/min) como cámaras de ioniación nano-Z-ESI.
Algunos detalles sobre equipamiento
con ESI-MS disponible y aplicaciones...
Lo que diferencia drásticamente a
los dos métodos de ionización suaves útiles para la volatilización / ionización
de moléculas termolábiles, UV-MALDI y ESI, y a su vez al segundo de todos los
demás métodos de ionización conocidos (EI, CI, FAB, FI, FD, etc. Ver detalle en
[1]), es que en éste se generan iones moleculares gaseosos policargados y que el
número de cargas (z) es casi proporcional al número de grupos polares presentes
y al peso molecular. Los iones gaseosos policargados resultantes, normalmente,
son iones moleculares intactos de masa m, cuya relación m/z está dentro de los
valores que los analizadores convencionales usados en MS hasta fines del 80
podían manipular (colimar, enfocar, frenar, acelerar y detectar) eficientemente
[2,12-13]. Por ejemplo, el análisis UV-MALDI-MS de la proteína comercial
albumina bovina (pm 66266 Da) muestra una única señal a m/z 67266 (Da) [(M+H)+],
mientras que el análisis por ESI-MS muestra una familia de 25 señales
comprendidas entre m/z 1658 y 1020, con 40 < z < 65 [14].
Por la razón antes señalada,
analizadores de uso rutinario en MS de moléculas termoestables de bajo peso
molecular, en general, moléculas orgánicas, fueron exitosamente acoplados al
ESI. Entre ellos basta mencionar el “quadrupolo” (Q), la combinación de sectores
eléctricos y magnéticos (E-B), el “quadrupolo tridimentional” o “trampa iónica”
(IT) y la “trampa iónica” combinada con un alto campo magnético denominado
“fourier transform-ion ciclotron resonance” (FT-ICR) [1,2,12]. Este hecho
determinó un rapidísimo desarrollo de la técnica ESI-MS, a tal punto que su
rápida y eficaz utilización en el análisis de biomoléculas, hizo pensar a
principios y mediados de la década del 90 que era de muchísima mayor utilidad en
este campo que el UV-MALDI-MS.
El uso combinado de los
analizadores, antes mencionados, para estudiar los procesos de fragmentación de
moléculas pequeñas y la secuenciación de estos procesos ha sido muy desarrollado
en las espectrometrías de masa convencionales (espectrometría de masa en tándem,
MS/MS y en general MSn). El ensamble del ESI con dichos analizadores en tándem
hizo surgir rápida y fácilmente la posibilidad de estudiar (i) la determinación
de peso molecular de biomolécula intacta, (ii) la fragmentación del ión
molecular de la biomolécula y (iii) la fragmentación selectiva de los iones
primarios formados. De esta manera se pudo usar desde los inicios la ESI-MS
tanto para determinar peso molecular (experimentos donde se genera el ión
molecular intacto) como para determinar estructura química (experimentos donde
se induce la fragmentacion del ión molecular) (uso de CAD; CID; “electron
capture dissociation” ECD, “infra-red multi photon decomposition” IRMPD; ver
modos de inducir fragmentación en la primer parte de este artículo [1]). En el
análisis de proteínas y polipéptidos, el estudio de la fragmentación de las
distintas generaciones de iones formados (fragmentación de ión molecular o ión
padre, fragmentación del hijo, fragmentación del nieto, etc., etc.) permite
determinar la estructura primaria o secuencia de los aminoácidos (Tabla 2) [1,
15-16]. En realidad la exitosa irrupción de la espectrometría de masa en el
campo de la proteómica se inició por medio de la ESI-MS, siguiendo el protocolo
denominado “bottom-up” (Tabla 2) [1, 15-16]. Cabe señalar que en la actualidad
en el campo de la proteómica, además del protocolo “bottom-up” se usa el
protocolo “top-down” efectuándose el análisis sobre la proteína intacta y su
fragmentación sucesiva total dentro del espectrómetro de masa. Los estudios
“top-down” se realizan sólo en equipos con ionización ESI del tipo ESI/FT-ICR
con excitación por ECD y IRMPD y son clave para el estudio de modificaciones
post-transduccionales (ver Tabla 2).
Tabla 2. Comparación del actual uso de
ESI-MS y UV-MALDI-MS en el análisis de proteínas.
|
Proteína
degradada enzimáticamente |
Proteína
intacta y Modificaciones
post-transduccionales |
Complejo
proteico | ||||
|
del
analito |
|
2D-LC/MS (ifenado) |
“Bottom-up” (“Genoma”
y “A
novo”)
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“Top-down”
a
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-Mezclas de
proteínas. |
(sobre la
mezcla) |
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(luego de
LC ó 2D-GE) |
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a Ver detalles en ref. [19].
b Ver detalles en ref. [19].
Equipos del tipo ESI-triple
“quadrupolo” (ESI-QqQ o ESI-QQQ o ESI-tripleQ) fueron de los primeros que
permitiron hacer proteómica, con el protocolo “bottom-up”.
La sensibilidad, resolución y
exactitud de los ESI-MS varía según las marcas y los modelos. En la actualidad
existen equipos más sofisticados donde al método de ionización ESI se lo combina
con analizadores también únicos que permiten hacer los dos experimentos antes
mencionados (sin fragmentación y con fragmentación). Estos analizadores son la
denominada “trampa iónica” (IT) y el llamado “fourier transfor-ion ciclotron
resonance” (FT-ICR) y los equipos serian ESI-IT y ESI-FT-ICR [2,12,16]. La
resolución, exactitud y sensibiliad son muy altas. También existen los equipos
que tienen en un arreglo en “tandem” dos analizadores de iones diferentes y a
los experimentos realizados se los denomina “espectrometría de masa tandem”
(MS/MS o MS2 ). El equipo clásico es el denominado ESI-Q-TOF que combina un
“quadrupolo” (Q) y el analizador TOF de alta sensibilidad y también existe la
combinación ESI-Q-IT [2].
Existen también equipos que combinan
el “analizador de tiempo de vuelo” del tipo ESI-TOF, donde el espectrómetro de
masa tiene solamente como analizador un “tiempo-de-vuelo” (TOF) y los
experimentos se realizan directamente en modo “reflectrón” (trayectoria de
iones: V; mayor exactitud en m/z, [1]), siendo útiles estos equipos sólo para
determinar el peso molecular (condiciones experimentales de no fragmentación),
ya que no tienen la opción de trabajar en el modo de operación que se denomina
PSD (“post source decomposition”, ver detalles en [1]). También los hay con la
combinación Q-TOF con un analizador TOF de mayor resolución, de doble reflejo
(trayectoria de iones: N) y de triple reflejo (trayectoriade iones:W). En estos
casos es posible efectuar estudios de secuenciación ya que el “quadrupolo” (Q)
filtra o selecciona al ion padre cuya fragmentación se va a analizar dentro de
TOF.
Todas las combinaciones
intrumentales anteriores admiten el uso tanto de ESI como de nano-ESI y, en
ambas escalas de trabajo, de la variante Z-ESI (Figs. 7-8).
Todos estos equipos tienen aún en la
actualidad la seria limitación de que el rango dinámico de operación está
limitado por el “quadrupolo” que como elemento de enfoque de iones forma parte
de la unidad ESI (Fig. 6). Teóricamente este rango puede
llegar a los 10000 Da. Sin embargo, en la mayoría de los equipos comerciales
este rango tiene una cota superior de 4000 a 6000 Da (Tabla 1). Tener presente
esta limitación instrumental es clave para entender que en un experimento
ESI-MS, independientemente del analizador de iones utilizado, la no obtención de
señales simplemente puede deberse a que los iones formados tienen valores de m/z
que caen fuera del rango dinámico del instrumento.
Cálculo de m y z .¿Quién los
efectúa? ¿Cuándo se efectúan?
Como ya se mencionó, el método de
ionización ESI difiere de todos los demás [1] porque para un analito de peso
molecular m, en lugar de detectarse una única señal a m/z con z = 1, se detecta
una familia de señales con diferentes m/z siendo z > 1. Como se muestra en la
Fig.9
en el ESI-MS de la mioglobina, analizado en modo positivo, no se detecta el ión
molecular monocargado a m/z = 16951 Da sino que se detecta una familia de
señales con valores de m/z comprendidos entre 808,221 y 1413,631 Da. Estos son
iones policargados por poliprotonación [M(H)n]n+ , con valores de z comprendidos
entre 21 y 12 (m/21 = 808,221 y m/12 = 1413,631 Da).
O sea que en realidad se obtiene una
serie del tipo [M+nH]n+ , [M+(n+1)H](n+1)+ , [M+(n+m)H](n+m)+
Como se ve, se genera una serie de
señales debidos a “quasi-iones moleculares” que difieren una de otra en un
hidrógeno en su “quasi-peso molecular” m y en unidad de carga en su valor de z.
Si conocemos el valor de n, el
problema está resuelto!
Afortunadamente estos cálculos se
efectúan en forma automática durante el experimento, mediante programas de
cálculo incluidos en el "soft" del equipo ESI-MS.
Básicamente los programas tienen en
cuenta para un posible valor de M, y una dada combinación de átomos
constituyentes de la molécula M, cúal es la relación teórica de intensidades
para cada señal de los iones “cuasi-moleculares” teniendo en cuenta la
abundancia isotópica natural de los elementos componentes. Para ese valor de M y
esa combinación de átomo constituyentes trata de encontrar el valor de n que
mejor calcula la distancia entre dos señales consecutivas.
Aquí aparece claramente cuan
importante es conocer el grado de pureza del analito y de la solución para saber
qué especie es la responsable de la carga de los iones “cuasi-moleculares”. El
sistema de ecuaciones es diferente si la series incluye sólo al H+ ( [M+nH]n+ ,
[M+(n+1)H](n+1)+ ……… [M+(n+m)H](n+m)+), o si incluye sólo al Na+ ( [M+nNa]n+ ,
[M+(n+1)Na](n+1)+ ……… [M+(n+m)Na](n+m)+), o si incluye a ambos y más complicado
es aún el sistema de ecuaciones si hay otros cationes en el medio. Esto es la
denominada “baja tolerancia de sales” o “interferencia de sales” en la
espectrometría de masa ESI (Tabla 1).
El programa efectúa en forma
iterativa estos cálculos tantas veces como sea necesario hasta encontrar el
valor óptimo de n. O sea aquél que daría por simulación un espectro ESI idéntico
al obtenido experimentalmente. Y…de esta manera, “mágicamente” aparecen en
pantalla los valores de z al lado de cada señal del espectro mientras se está
efectuando el experimento.
Sólo hay que darle al programa como
información (i) el umbral de sensibilidad del experimento, (ii) quién es la
especie responsable de la carga (H+ y/o catión metálico) y (ii) cuáles serían
los elementos constituyentes del analito, de manera de evitar que el programa
“por default” considere todas las combinaciones posibles de la Tabla Periódica!
De esta manera se obtiene no
solamente el valor de n sino además el valor del peso molecular del ión
molecular intacto, M.
Como se muestra en la Fig. 10 para la hemoglobina humana, el
análisis por ESI-MS en modo positivo mostró la familia de iones policargados
para cada una de las cadenas (A, alfa; B, beta; G, gama) indicando al lado de
cada señal el valor de z calculado ((a) espectro obtenido experimentalmente). En
la parte (b) se muestra la ubicación de los iones moleculares monocargados
correspondientes a las cadenas A y B en el espectro simulado por el mismo
programa de cálculo.
En la Fig. 11 se muestra el primer ejemplo
descripto por Fenn [3] de cálculo del peso del ión molecular monocargado de una
proteína (citocromo C, pm 12384,5 Da, espectro insertado) cuyo espectro de masa
ESI mostró, en modo positivo, la familia de iones policargados debido a
poliprotonación, con m/z en el rango 600 – 1100 Da (z entre 12 – 21).
Para terminar ...complejos proteicos
y polímeros sintéticos
Finalmente, para complementar en
imágenes el panorama de aplicaciones actuales de la técnica ESI-MS
[3,12-13,15-16], en las Figs 12-13 se
muestran complejos proteicos en la primera [17] y polímeros sintéticos del tipo
silsesquioxanos en la segunda [18]. En la Fig. 12 (imagen superior) se muestra, el
espectro obtenido en modo positivo para el complejo proteíco nativo de la
chaperona MtGimC aislada y purificada y en la Fig. 12 (imagen inferior) los espectros
obtenidos analizando sucesivamente alícuotas de una solución que ha sido
preparada mezclando cantidades equimoleculares de las unidades proteicas alfa y
beta que es sabido que forman el complejo proteico nativo [17]. Esta interesante
aplicación se basa en la ya mencionada particularidad de la ESI que es la de
mantener entre las unidades proteicas gaseosas policargadas las mismas
interacciones intermoleculares que están presentes en la solución. Por supuesto
que esto es válido no sólo para proteínas, sino para analitos en general.
En cuanto a sus aplicaciones a
polímeros sintéticos, en la Fig 13 se muestran los espectros de masa
UV-MALDI-TOF y ESI obtenidos en modo positivo para un polímero sintético. Este
contiene en su estructura Si (silsesquioxanos) y del espectro UV-MALDI
(Fig. 13(a)), se concluye que su peso molecular
promedio es del orden de 5000 Da, coincidiendo este valor con el obtenido por
SEC (cromatografía de exclusión por tamaño, [18a]). En el mismo espectro se
observa la distribución gaussiana esperada de los oligómeros constituyentes
(información cuantitativa). Por el contrario, el espectro ESI (Fig. 13(b)) muestra a primera vista un aspecto
totalmente diferente. No solamente las señales aparecen a valores de m/z menores
debido a la policarga (ESI, m/z entre 2200 – 3000 Da; UV-MALDI, m/z entre 4000
–6500 Da) sino que, además, se pierde la imagen de distribución gaussiana de los
oligómeros debido al entrecruzamiento de señales de los diferentes oligómeros
policargados. Con este último ejemplo se muestra claramente que en el análisis
de mezclas en general, sean o no éstas oligómeros de polímeros naturales o
sintéticos, se requiere para la interpretación de la información obtenida por
ESI-MS disponer de los espectros obtenidos por UV-MALDI-MS.
Referencias
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Del vuelo de las proteínas y de cómo lograrlo (espectrometría de masa UV-MALDI).
Quimica
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*Dra. Rosa
Erra-Balsells. E-mail:
erra@qo.fcen.uba.ar
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Revista
QuímicaViva Número 3, año 3, septiembre 2004 quimicaviva@qb.fcen.uba.ar |