Generación de una línea de CME reportera de la transcripción y localización del locus del FT Nanog utilizando el sistema STREAMING-tag

Melanie Aranovich ¹ - Sabrina Lorena Roberti ¹ - Candelaria Díaz ¹ - Santiago Cavedo ¹ - Lucila Boto ¹ - Luciana Gorosito ¹ - Valeria Levi ^1,2 - Alejandra Guberman ^1,3

1 Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN), CONICET-UBA, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Buenos Aires, Argentina
2 Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Química Biológica, Buenos Aires, Argentina
3 Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Fisiología y Biología Molecular y Celular, Buenos Aires, Argentina

Las células madre embrionarias (CMEs) son un tipo de célula pluripotente. Los factores de transcripción (FT) Oct4, Sox2 y Nanog componen el core de pluripotencia. La expresión de Nanog disminuye abruptamente al comienzo de la diferenciación, por lo que es un excelente marcador de pluripotencia naïve, representante del embrión preimplatatorio. El objetivo de este trabajo es generar líneas de CMEs que permitan monitorear la expresión y la localización del locus de Nanog por fluorescencia en CMEs vivas. Para esto, utilizamos el sistema STREAMING-tag, basado en la inserción de un cassette en una región de interés mediante CRISPR-Cas9. El mismo contiene repeticiones de MS2, reconocidas en el RNA naciente por la proteína MCP fusionada a mScarlet (MCP-mS) y secuencias de Tet Operator, reconocidas por Tet Repressor fusionado a mNeonGreen (TetR-mNG) para detectar el locus. Los genes que codifican estas proteínas se integran en el genoma por la transposasa PiggyBac. Además, contiene el gen NeoR permitiendo la selección de knock in (KI). Generamos el KI en la línea de CMEs W4 en una región cercana al sitio de inicio de transcripción (TSS) de Nanog. Obtuvimos un pool de células probablemente KI e insertamos las secuencias de TetR-mNG y/o MCP-mS. Identificamos regiones de alta concentración de ambas proteínas de fusión mediante microscopía confocal. Detectamos algunas células con un solo punto y otras con dos, probablemente correspondientes a la inserción del cassette en uno o ambos alelos de Nanog, respectivamente. Estamos generando líneas clonales seleccionando células que expresen un nivel apropiado de fluorescencia de TetR-mNG y/o MCP-mS, validando las líneas generadas mediante RNA-FISH utilizando una sonda de Nanog y realizando análisis funcionales. Una vez validadas, las líneas serán una herramienta poderosa utilizada en varios proyectos para estudiar los mecanismos moleculares involucrados en el mantenimiento de la pluripotencia.