Explorando condensados transcripcionales mediante seguimiento de moléculas individuales

Alejo Vázquez Lareu ^1,2 - Maria Candelaria Diaz ¹ - Diego Martin Presman ^2,4 - Valeria Levi ^1,3

1 Instituto de Instituto de Química Biológica (IQUIBICEN), CONICET-UBA, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 2 Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias (IFIBYNE), CONICET-UBA, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; 3 Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires; 4 Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires

En los últimos años, la microscopía reveló que muchas moléculas involucradas en la transcripción no se distribuyen uniformemente en el núcleo, sino que se agrupan en focos discretos denominados condensados transcripcionales. Aunque los principios físicos de su formación siguen en debate, existe evidencia sólida de que tienen un rol en la regulación génica.
Las técnicas de microscopía de fluorescencia son herramientas valiosas para estudiar procesos biológicos en células vivas. Entre ellas, el seguimiento de moléculas individuales (SMT) posibilita visualizar y rastrear moléculas sin promediar las observaciones, permitiendo identificar subpoblaciones o incluso moléculas experimentando transiciones entre estados de manera asincrónica. Por ello, SMT es ideal para investigar procesos complejos como la regulación génica.
En este trabajo desarrollamos y optimizamos SMT en un microscopio Zeiss Elyra 7, combinando iluminación oblicua para reducir la excitación fuera de foco y una cámara EMCCD rápida y sensible. Experimentos con moléculas fijadas de la sonda JF646 mostraron una precisión de localización de ~20 nm y una resolución temporal de 18,5 ms. Para evaluar el desempeño del método utilizamos al receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción que forma condensados. Los parámetros obtenidos, como el tiempo de residencia en cromatina, coincidieron con valores reportados.
Finalmente, utilizamos SMT para investigar si condensados de factores de pluripotencia como SOX2 modulan la organización de la cromatina. Combinamos SMT de H2B-JF646 con la visualización de condensados de SOX2-YPet en células madre embrionarias de ratón. El análisis del desplazamiento cuadrático medio de H2B mediante un modelo de difusión confinada mostró que los nucleosomas presentan movilidad más restringida dentro de los condensados de SOX2. Estos resultados sugieren que SOX2 influye en la organización y accesibilidad de la cromatina.