Caracterización bioquímica de una proteína dimérica de unión al AMPc con actividad purina nucleósido fosforilasa en Trypanosoma cruzi

Sofía Mayu Sanada ¹ - Guillermo Tomás Di Mario ¹ - Martín Miguel Edreira ^1,2

1 IQUIBICEN
2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, School of Medicine, University of Pittsburgh

Las vías de señalización dependientes de AMP cíclico (AMPc) en T. cruzi se encuentran involucradas en diversos procesos celulares, tales como la diferenciación y la invasión de la célula hospedadora. Entre las potenciales proteínas efectoras del AMPc previamente identificadas por bioinformática, se seleccionó TcCLB.504449.30 (P4 a partir de ahora) para su caracterización funcional y estructural. A partir de una búsqueda de dominios funcionales conservados mediante InterPro, junto con un análisis estructural predictivo por AlphaFold, se comprobó que esta proteína presentaría, además de la capacidad de unión a AMPc, un potencial dominio de homo-dimerización (DD) y un dominio catalítico de purina nucleósido fosforilasa (PNP). Para demostrar la formación de un dímero estable, el dominio putativo DD fue sobreexpresado en E. coli BL21 como proteína de fusión a una etiqueta de histidinas (His) o a glutatión transferasa. Estas fueron empleadas en ensayos de precipitación diferencial utilizando una resina de sefarosa-GSH, seguido de un Western Blot con anticuerpos anti-His. Este hallazgo sugeriría la formación de un homo-dímero de P4, siendo un mecanismo estructural novedoso para este tipo de proteínas en T. cruzi. Paralelamente, análisis estructurales in silico mediante dinámica molecular evidenciaron la estabilidad del complejo, reforzando la relevancia funcional de la oligomerización. Por otra parte, la incubación de lisados bacterianos sobreexpresando el dominio putativo PNP con guanosina fue analizada mediante un ensayo espectrofotométrico UV-Vis. Resultados preliminares indicaron un aumento en la concentración de guanina, confirmando la presencia de actividad enzimática. En conjunto, nuestros resultados describen a P4 como una proteína con un rol dual en T. cruzi, capaz de unirse a AMPc al adoptar una conformación estructural novedosa, y de catalizar la fosforólisis de nucleósidos.