P7 - Métodos de EVs

Detección de EVs marcadas con CFSE en Citómetro Cytek - Northern Lights

Daniel Grasso ^1,2 - Maximiliano Diaz ^1,3 - Valentin Yzetta ¹ - Laura Sobrado ¹ - Marcela Cucher ^2,4 - Maria Eugenia Santana ^2,4 - Tomas Lombardo ^1,3 - Carla Pascuale ⁵ - Maria Noé Garcia ^1,3 - García, María Noé ^1,3

1) Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU), CONICET, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina
2) Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.
3) Cátedra de Inmunología, Departamento de Microbiología, Inmunología, Biotecnología y Genética, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.
4) Instituto de Investigaciones de Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM, UBA-CONICET), Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.
5) Gematec S.R.L.
Contacto: mn.garcia@ffyb.uba.ar

La escala nanométrica y la coexistencia de partículas con características fisicoquímicas similares representan un verdadero desafío técnico para el estudio de vesículas extracelulares (EVs). En este contexto es aconsejable el uso de ensayos ortogonales y complementarios para la consolidación de resultados experimentales. A pesar de trabajar cerca del límite de detección, la citometría de flujo (CF) es una tecnología multiparamétrica versátil capaz de identificar EVs individuales. Sin embargo, debido a los desafíos de la CF para la detección de EVs, es necesaria una cuidadosa puesta a punto previa a la validación de resultados. Nuestro objetivo fue evaluar el desempeño y puesta a punto para la detección de EVs con el citómetro espectral Cytek Northern Lights 3000. Se utilizaron EVs, fracciones small (sEVs) y medium (mEVs), de la línea celular PANC1 enriquecidas por centrifugaciones diferenciales. Se evaluaron diferentes protocolos para la tinción de las EVs con el colorante carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE). Se ensayaron concentraciones crecientes de CFSE (3, 7, 15 y 40 µM). Asimismo, se realizaron diluciones seriadas de las muestras para evaluar el rango dinámico de detección. Se evaluó el efecto de dos diluyentes (PBS y H2O), así como el exceso de colorante en el medio. Tanto sEVs como mEVs se resolvieron correctamente con un rango dinámico y linealidad muy aceptables. En base a los resultados determinamos una concentración optima de CFSE en 7-15 µM a 30 min 37°. Interesantemente, el lavado post-tinción fue contraproducente en cuanto a la pérdida de eventos detectables en la muestra. Por último, mediante el uso de microesferas coloreadas de tamaño conocido pudimos determinar una relación aproximada del tamaño de las EVs marcadas. En conclusión, se definió un protocolo efectivo de tinción de EVs para citometría con CFSE fácil y rápido que puede resultar sumamente útil para el estudio de estas vesículas.

Palabras clave: CITOMETRÍA DE FLUJO, CFSE, DETECCIÓN DE EVs INDIVIDUALES.