P11 - Métodos de EVs

Comparación de métodos para el aislamiento de vesículas extracelulares a partir de suero y plasma humano

Weber CA¹ - Muñoz EM¹ - Zanetti MN² - Jacob J³ - Bello OD¹

1) Laboratorio de Neurobiología Básica y Traslacional, Instituto de Histología y Embriología de Mendoza (IHEM)-CONICET- UNCuyo, Mendoza, Argentina.
2) Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo (IMBECU) -CONICET-UNCuyo, Mendoza, Argentina.
3) Laboratorio de Fisiología y Fisiopatología del Glóbulo Rojo, Instituto de Histología y Embriología de Mendoza (IHEM)-CONICET UNCuyo, Mendoza, Argentina.
Contacto: Webermendozaconicet@gmail.com

Las vesículas extracelulares (VEs) son estructuras de tamaño nanométrico secretadas por todas las estirpes celulares, incluyendo las neuronales y gliales. Actúan como nano-transportadores naturales acarreando moléculas: proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, que, pueden, en algunos casos, actuar como mensajeros paracrinos o bien, desempeñar funciones claves en la comunicación intercelular. Dada la capacidad de las VEs de atravesar barreras como la BHE, las mismas pueden detectarse en sangre periférica y otros fluidos biológicos. Debido a ello las VEs representan una fuente no invasiva prometedora de biomarcadores para diversas enfermedades, entre ellas, las enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, su aislamiento eficiente y específico representa un desafío técnico no solo por la baja concentración de las VEs circulantes sino también porque el rendimiento y la pureza varían según el método utilizado. El objetivo de este trabajo fue comparar tres métodos de aislamiento de VEs a partir de suero y plasma humano: precipitación con polietilenglicol (PEG), ultracentrifugación (UC), y un kit comercial (KIT- Invitrogen, Total Exosome Precipitation Reagent). En los tres casos, se analizaron fracciones de los precipitados mediante Western Blot (WB), utilizando el marcador exosomal CD63, y por tinción total de proteínas (Ponceau). Los resultados mostraron que los tres métodos permiten aislar VEs detectables por WB, aunque con algunas diferencias. El KIT presentó el mayor rendimiento en cuanto a la señal de CD63, pero con una alta carga proteica inespecífica. PEG mostró un buen resultado entre la recuperación y la pureza. Finalmente, la UC fue el método más limpio, pero el más ineficiente. Estos hallazgos sugieren la importancia de seleccionar el método de aislamiento apropiado en función de los objetivos de cada estudio y de los análisis posteriores que se desean realizar. Cabe destacar que la estandarización metodológica es clave para aplicaciones diagnósticas basadas en VEs.

Palabras clave: VESÍCULAS EXTRACELULARES, AISLAMIENTO, CD63.