Evaluación de la actividad antibacteriana y antifúngica de los extractos etanólico y acuoso de hojas de Calotropis procera (Aiton) Dryand.

Mijail Mijares Bullaín Galardis 1, Raúl Carlos López Sánchez1 Roberto Carlos Muñoz Leyva2,José Ángel Morales León3, Róbinson Hermosilla Espinoza3

1Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal y 2 Departamento de Producción Vegetal. Facultad de Ciencias Agropecuarias.3Centro de estudios de Química Aplicada. Facultad de Ciencias Técnicas. Universidad de Granma. Peralejo. Provincia Granma. Cuba.

mbullaing@udg.co.cu

Recibido: 12/03/2019 - Aceptado: 14/03/2019

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Resumen

En Cuba Calotropis procera (Aiton) Dryand.se emplea como planta medicinal. De las hojas se obtuvieron los extractos etanólico y acuoso mediante la extracción asistida por ultrasonido y se llevaron a sequedad por rotoevaporación. La actividad antibacteriana y antifúngica se evaluó mediante el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco de Bauer-Kirby con modificaciones. Los extractos no mostraron actividad frente a las bacterias Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus; y tampoco inhibieron el crecimiento de las levaduras Candida albicans y Saccharomyces cerevisiae. El tamizaje fitoquímico preliminar mostró la presencia de grupos de metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana pero en pequeñas cantidades lo que pudo influir en los resultados obtenidos.

Palabras clave: Calotropisprocera, actividad antibacteriana, actividad antifúngica, tamizaje fitoquímico

Summary

In Cuba Calotropis procera (Aiton) Dryand is used as a medicinal plant. From the leaves, the ethanolic and aqueous extracts were obtained by ultrasound-assisted extraction and brought to dryness by rotoevaporation. The antibacterial and antifungal activity of the extracts was evaluated by means the diffusion method in agar by superficial disc dissemination of Bauer-Kirby with modifications.The extracts showed no activity against the bacteria Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus; and they also did not inhibit the growth of the yeasts Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae. The preliminary phytochemical screening showed the presence of groups of secondary metabolites with antimicrobial activity but in small quantities which could influence the results obtained.

Keywords: Calotropis procera, antibacterial activity, antifungal activity, phytochemical screening

Introducción

Desde tiempos inmemoriales, en las diferentes culturas, el hombre ha utilizado las plantas medicinales para tratar y curar diversas enfermedades causadas por microorganismos patógenos. En la actualidad se observa un fenómeno de multirresistencia a los agentes antimicrobianos convencionales debido, entre otras causas, a su uso indiscriminado.

Esta situación, así como la aparición de efectos indeseables de ciertos antibióticos, ha llevado a los científicos a investigar nuevas sustancias antimicrobianas a partir de plantas consideradas popularmente medicinales [1].

Debido a esta problemática, una de las más serias que enfrenta la ciencia médica en la actualidad, organizaciones como la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Panamericana de la Salud (OPS) han promovido el desarrollo de programas para la identificación, investigación, cultivo y conservación de plantas medicinales como fuente natural de principios activos para la obtención de nuevos agentes antimicrobianos.

Para realizar este trabajo resulta importante tener en cuenta el conocimiento empírico acumulado por la población en cuanto al manejo y uso de estas especies de plantas e incorporar los conocimientos técnicos especializados para optimizar estos procesosy favorecer de forma efectivala conservación de estos importantes recursos filogenéticos [2].

La flora cubana es muy rica y variada, presenta más de un 50% de endemismo y, en algunas zonas entre el 70% y 80% de las especies tienen propiedades medicinales, sin embargo, ha sido poco estudiada, lo que ha limitado su explotación y aprovechamiento [3-5].

Calotropis procera (Aiton) Dryand., de la familia Apocynaceae, es conocida por los nombre comunes algodón de ceda, bomba, tula [6], algodón de la India [7], en Cuba se le nombra algodón americano, algodón de Judea, algodón de seda, algodón de playa, árbol de Judea, árbol de seda, cazuela, estrella de Holanda y estrella del norte [8].

Las raíces, el látex y la corteza de las raíces de la planta se emplean en la medicina tradicional para inducir el vómito y como laxante natural. Es también utilizada para combatir los síntomas provocados por diferentes enfermedades cutáneas (lepra, infecciones cutáneas bacterianas) y otras enfermedades como la sífilis [9]. Se le atribuyen también propiedades antinflamatorias y antisépticas [10].

Los reportes hallados en las fuentes consultadassugieren que los extractos etanólico y acuoso de hojas de C. procerapresentan actividad antibacteriana y antifúngica.

Materiales y métodos

Colecta, identificación y selección del material vegetal

La colecta del material vegetal se realizó el 20 de mayo de 2018 en Blanquizal, municipio Manzanillo, provincia Granma, Cuba (coordenadas 20°20'43.476" N -77°5'4.416") a las 8:00 am., a una temperatura de 32°C y una humedad relativa de 78%.

La planta fue identificada en el Jardín Botánico Cupaynicú, por el Dr. C. Luis Catasús Guerra, (número de Voucher: 251)[11].

La clasificación del material vegetal se realizó según la NRSP 309 [12]. Se desecharon las hojas que no reunían las condiciones para ser utilizadas en la investigación. La desinfección se realizó según el procedimiento reportado por Carballo y col [13], con modificaciones: lavado con agua potable e inmersión en disolución de hipoclorito de sodio al 3 % durante 15 minutos.

Las hojas se secaron a la sombra sobre planchas de cartón perforadas durante 10 días removiendo el material tres veces al día, y luego en una estufa universal (Memmert UNB 200, Alemania) con circulación de aire a 40°C durante 3 horas. Se obtuvo un polvo empleando un molino (IKA, modelo MF 10 Basic, Alemania).

Obtención de los extractos

50 g del polvo de las hojas se humectaron con etanol al 70 % y con posterioridad se adicionaron 250 mL de la misma solución. Se realizó una extracción asistida por ultrasonido (Ultrasonic Cleaner SB-120DT, China) a una temperatura de 40°C, frecuencia de 40 KHz durante dos horas [14,15]. Luego de la extracción se retiró el extracto etanólico del balón y se dejó reposar el material vegetal durante 24 horas a temperatura ambiente. El procedimiento fue repetido empleando agua como disolvente.Como resultado se obtuvieron los extractosetanólico y acuoso.

Los extractos se filtraron a presión reducida y se almacenaron en recipientes de color ámbar, se dejaron en reposo durante 48horas a 8°C, transcurrido este tiempo se filtraron.

Obtención de los extractos secos

Los extractos secos fueron obtenidos mediante un procedimiento de evaporación rotatoria a 60rpm. Se utilizó un rotoevaporador (IKA, RV10digital, Alemania) conectado a un baño con termostato (IKA, HB10, Alemania), un termostato de refrigeración y recirculación(LAUDA ALPHA RA 24, Alemania) y una bomba de vacío (PC 500 series, Alemania).

Evaluación de la actividad antibacteriana

El ensayo se realizó en una cabina de flujo laminar vertical (FASTER, TWO 30, Italia)por el método de difusión en agar por diseminación superficial en disco de Bauer-Kirby [16,17], con modificaciones.

Los inóculos se elaboraron de colonias aisladas incubadas por 24 horas, se ajustaron al patrón de turbidez 0,5 de McFarland para una concentración de aproximadamente 1,5 × 108 unidades formadoras de colonias por mililitros (UFC/mL).

La inoculación de las placas se realizó mediante la siembra en césped sobre agar Mueller-Hinton (BioCen, Cuba, lote: 4100001) (pH 7,3 ± 0,2) con hisopos con punta de algodón estériles.

Fue utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) como disolvente para obtener disoluciones stock de cada extracto a una concentración de 248 mg/mL.

Sobre una placa de Petri se colocaron discos de papel de filtro (MACHEREY-NAGEL, Alemania) de 6 mm de diámetro previamente esterilizados y se les adicionó 5 µL de la disolución stock cargándolos con 1240 µg/disco. Con la ayuda de una pinza se situaron los discos impregnados de cada extracto sobre las placas previamente inoculadas.

Las placas inoculadas y con los discos cargados de ambos extractos se incubaron a 37 ± 0,1 ºC durante 24 horas en una incubadora (MemmertINB 200, Alemania). Las zonas de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor de los discos fueron medidas en milímetros.

Se utilizaron como controles negativos, discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro cargados con 5 μL de DMSO; y como controles positivos, discos de los antibióticos comerciales Azitromicina, Ciprofloxacina y Gentamicina (Sensi–Disc, Francia) de 15, 5 y 10 µg/disco, respectivamente. Los resultados se declararon como el promedio del diámetro de los halos de inhibición para cada tratamiento.A cada tratamiento se le realizaron tres repeticiones.

Bacterias evaluadas

Se emplearon cinco géneros bacterianos, dos de referencia internacional, depositadas en el American Type Culture Collection (ATCC) y dos salvajes aisladas en el Centro de Higiene y Epidemiología del municipio Manzanillo, provincia Granma.

Evaluación de la actividad antifúngica

El método empleado fue difusión en agar por diseminación superficial en disco de Bauer-Kirby [18].

Fueron utilizadaslas levaduras Candida albicans (salvaje),aislada en el Centro de Higiene y Epidemiología del municipio Manzanillo, provincia Granma, Cuba y Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763). La siembra e inoculación de las placas con Candida albicans se realizó en agar Mueller-Hinton (BioCen, Cuba, lote: 4100001) (pH 7,3 ± 0,2) suplementado con 2 % de glucosa y 0,5 µg/mL de azul de metileno, mientras que la siembra e inoculación de las placas con Saccharomyces cerevisiae se realizó en agar dextrosa Sabouraud (BioCen, Cuba, lote: 3500004) (pH 5,6 ± 0,2). Los inóculos se elaboraron de colonias aisladas incubadas por 24 horas, se ajustaron al patrón de turbidez 0,5 de McFarland para una concentración aproximada de 1,5 × 108 UFC/mL. Las placas inoculadas y con los discos cargados con los extractos a evaluar se incubaron durante 48 horas a 29 ± 1°C. Se utilizó como control negativo el mismo que se empleó en la evaluación de la actividad antibacteriana y como control positivo, discos del antifúngico Fluconazol de 30 µg/disco (Sensi–Disc, Francia). El ensayo se realizó por triplicado bajo estrictas condiciones de asepsia en una cabina de flujo laminar vertical (FASTER, TWO 30, Italia).

Tamizaje fitoquímico

Se realizó para identificar los grupos de metabolitos secundarios presentes en los extractos etanólico y acuoso de hojas de C. procera, los ensayos realizados fueron los establecidos para cada extracto teniendo en cuenta el solvente empleado en su extracción según la metodología empleada por Rondina y Coussio [19] y Sandoval y Suárez [20].

Resultados

Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad bacteriana de los extractos de las hojas de C. procera son reportados en la Tabla 1. Como se observa, estos productos son inactivos frente a las cepas ensayadas.

Tabla 1: Evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos de las hojas de C. procera.

Sustancias
a evaluar
Halos de inhibición (mm) frente a cepas bacterianas
Bacillus subtilis
(ATCC 6633)
Gram-positiva
X ± S
Staphylococcus aureus
(Salvaje)
Gram-positiva
X ± S
Escherichia coli
(Salvaje)
Gram-negativa
X ± S
Salmonella typhimurium
(ATCC 14028)
Gram-negativa
X ± S
etanólico----
acuoso----
gentamicina26,3±0,618,7±0,619,3±0,618,3±0,6
ciprofloxacina16,3±0,621,3±0,6-19,0±1,0
azitromicina18,3±0,627,7±0,6-17,3±0,6
DMSO----

(-): Resultado negativo en la inhibición del crecimiento bacteriano; DMSO:dimetilsulfóxido;X: media; s: desviación estándar.

El dimetilsulfóxido, solvente empleado para resuspender los extractos y utilizado como control negativo en el ensayo no inhibió el crecimiento bacteriano, lo que sugiere que su empleo en la obtención de las disoluciones stock no alteró los resultados obtenidos.

Los antibióticos comerciales empleados como controles positivosse comportaron según lo esperado ya que las cepas bacterianas empleadas en este ensayo mostraron la resistencia y sensibilidad previstas. Esto indica que las condiciones en que se realizó el ensayo y los procedimientos realizados cumplieron las normas establecidas.

De igual modo, los extractos tampoco inhibieron el crecimiento de las levaduras empleadas en el estudio (Tabla 2).

Tabla 2: Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos de las hojas de C. procera.

Sustancias
a evaluar
Halos de inhibición (mm) frente a levaduras
Candida albicans
(Salvaje)
X ± S
Saccharomyces cerevisiae
(ATCC 9763)
X ± S
etanólico--
acuoso--
fluconazol18,3±0,622,3±0,6
DMSO--

(-): Resultado negativo en la inhibición del crecimiento bacteriano; DMSO:dimetilsulfóxido; X: media; s: desviación estándar.

Tanto en la evaluación de la actividad antibacteriana como en la antifúngica, el dimetilsulfóxido no inhibió el crecimiento de las cepas empleadas, por consiguiente, es un disolvente adecuado para la elaboración de las disoluciones stock. El fluconazol, utilizado como control positivo se comportó según lo previsto al inhibir el crecimiento de ambos microorganismos.

El tamizaje fitoquímico practicado demostró que los metabolitos secundarios presentes en las hojas de la planta son alcaloides, aminoácidos libres, azúcares reductores, fenoles, flavonoides, quinonas, resinas, saponinas, taninos y triterpenos (Tabla 3).

Tabla 3: Tamizaje fitoquímico realizado a los extractos acuoso y etanólico de hojas de C. procera.

MetabolitosHojas
AcEt
Alcaloides++
Aminoácidos libres+
Antocianinas-
Azúcares reductores-+
Coumarinas-
Esteroles-
Fenoles++
Flavonoides++
Mucílagos-
Quinonas+
Resinas+
Saponinas+-
Taninos++
Triterpenos++

Ac: Extracto acuoso; Et: Extracto etanólico; (-): Ausente; (+): Presente; (++): Abundante; (en blanco): No se realizó el ensayo.

Discusión

Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antibacteriana de C. procera confirman los estudios anteriores de Mossa y col (1991) que plantearon que los extractos de C. procera están desprovistos de cualquier actividad antibacteriana y antifúngica [21].Una observación similar fue realizada por Mainasara y col (2012) que demostraron la inactividad el extracto etanólico de las raíces frente a S. aureus, E. coli y S. typhimurium [22]. Sin embargo, entran en contradicción con los obtenidos por Shobowale y col (2013) quienes reportaron la inhibición del crecimiento de E. coli, S. typhimurium y C. albicans bajo la acción de los extractos etanólico y acuoso de hojas de C. procera [23], no obstante, ambos extractos no mostraron actividad frente a B. subtilis, lo cual coincide con los resultados obtenidos en esta investigación.

En el caso de las levaduras, los resultados corroboran el reporte de Farouky col (2016) quienes observaron que el extracto acuoso de hojas y los extractos etanólicos y acuosos de flores, frutos y látex de C. procerano inhibieron el crecimiento de C. albicans; tampoco mostraron actividad frente a C. albicans los extractos de hojas, flores, frutos y látex obtenidos con el empleo de acetona y alcohol isoamílico[24]. Nenaah (2013) constató que el extracto de hojas obtenido con el éter de petróleo como solvente no fue activo frente a S. cerevisiae [25].

La mayor parte de los grupos de metabolitos secundarios detectados en el tamizaje fitoquímico coinciden con los identificados por otros autores, con la excepción de los triterpenos, en ningún caso su presencia fue abundante.

Mainasara y col (2012) observaron la presencia de taninos, flavonoides y alcaloides en el extracto acuoso y etanólico de hojas de C. procera. También observaron la presencia de saponinas en el extracto acuoso y la ausencia de estas y de esteroles en el extracto etanólico [22].

Un resultado similar obtuvieron Zaman y col (2017) quienes determinaron la presencia de alcaloides, taninos, aminoácidos libres y flavonoides en el extracto etanólico de hojas, sin embargo,como elemento contradictorio también observaronla presencia de saponinas en este extracto [26]. Akindele y col (2017), también determinaron la presencia de alcaloides, flavonoides, fenoles, taninos y saponinas en el extracto acuoso y etanólico de hojas, aunque en esta investigación no se observó la presencia de saponinas en el extracto etanólico [27].

Morsy y col (2016) reportaron la presencia de flavonoides y saponinas, pero no observaron taninos, alcaloides, coumarinas y antocianinas en el extracto metanólico de hojas [28]. La ausencia de antocianinas, coumarinas y la presencia de flavonoides en esta investigación corrobora los resultados obtenidos por estos autores.

La actividad biológica de los extractos de origen vegetalestá determinada por la presencia y concentración de determinados metabolitos secundarios, por ejemplo, la actividad antimicrobiana está relacionada con la presencia dealcaloides, azúcares reductores, fenoles, quinonas, saponinas y taninos [29-33].

Además, la presencia y concentración de los metabolitos secundarios en las plantas están sujetas a un control genético, y su expresión puede sufrir modificaciones resultantes de la integración de procesos bioquímicos, fisiológicos, ecológicos y evolutivos. Por consiguiente, la síntesis de metabolitos secundarios puede considerarse como una adaptación química de las plantas los cambios del ambiente [34].

En muchos casos los cambios en las concentraciones de metabolitos secundarios pueden ser resultado del desarrollo foliar y del surgimiento de nuevos órganos, lo que puede provocar una disminución de su concentración y al mismo tiempo, aumentar debido al crecimiento de la biomasa [35, 36].

La edad y el desarrollo de la planta y de los órganos vegetales también son de gran importancia y pueden influir en la cantidad y variedad de metabolitos producidos, pues en muchas especies los tejidos nuevos generalmente poseen mayor tasa biosintética de metabolitos [37].

Otro factor que influye en el desarrollo de las plantas, y por tanto en la producción de metabolitos secundarios, es la frecuencia con la que ocurren las variaciones anuales, mensuales y diarias en la temperatura del lugar donde crece la planta [38].

Por otro lado, varios procesos fisiológicos, tales como fotosíntesis, movilización de reservas, comportamiento estomático, expansión foliar y crecimiento pueden ser alterados por el potencial hídrico de la planta y por consiguiente provocar cambios en el metabolismo secundario y la producción de metabolitos [39-41].

La disponibilidad de nutrientes es otro factor que puede ser responsable de diferencias en la producción de metabolitos secundarios, su déficit no sólo afecta el metabolismo primario, sino que también afecta la producción de diferentes metabolitos secundarios [42]. El pH del suelo también es determinante en el desarrollo de las plantas y en el metabolismo primario y secundario [38].

Tienen una gran influencia en la producción de metabolitos secundarios y en sus concentraciones los estímulos mecánicos como los causados por la lluvia, el viento, la invasión por patógenos, ataques de herbívoros [38,43-45].

La época de recolección es uno de los factores de mayor importancia ya que la cantidad y la naturaleza de los metabolitos secundarios no es constante durante algunos períodos. Puede inferirse entonces que la ausencia de saponinas en el extracto etanólico y la presencia de estas en el extracto etanólico en la investigación realizada por Zaman y col (2017) pudo estar determinada por diferencias en la época de recolección pues la colecta del material vegetal se realizó en el mes de enero [26].

La extracción de metabolitos secundarios depende, entre otros factores, de la naturaleza del grupo al que pertenece, estructura, grado de polimerización y su relación con la polaridad del solvente utilizado en la extracción [46].Esto puede ser la causa de que Morsy y col (2016) observaron la presencia de saponinas y la ausencia de alcaloides y taninos en el extracto metanólico de hojas [28], mientras que en esta investigación al emplear el etanol como solvente los resultados para estos grupos de metabolitos fueron totalmente opuestos.

Un ejemplo de esto lo constituye lo observado por Do y col (2014) en un estudio relacionado con la extracción de fenoles con distintos solventes y métodos de extracción, quienes reportan que la extracción fue más efectiva aumentando el contenido de agua, lo que puede estar relacionado con la solubilidad de los compuestos en este solvente [47].

El método de extracción empleado también pudo influir en los resultados de la actividad antimicrobiana y del tamizaje fitoquímico, pues en este proceso influyen varios parámetros en el rendimiento de la extracción de metabolitos como por ejemplo, el tiempo de extracción, la temperatura, la relación solvente/sólido y el número de etapas de extracción [48,49]. Es por ello que las diferencias entre los resultados de la evaluación de la actividad antimicrobiana y los obtenidos por Shobowale y col (2013) podrían estar dadas en que estos autores emplearon la maceración como método de extracción [23].

El método utilizado para realizar el ensayo de evaluación de la actividad antimicrobiana también pudo influir en las diferencias observadas entre estas investigaciones, variables como la concentración del inóculo, el medio de cultivo empleado, el tipo de difusión, el tiempo y la temperatura de incubación de las placas tienen gran efecto en los resultados. Tal es el caso de los resultados obtenidos por Shobowale y col (2013) en la evaluación de la actividad antifúngica de los extractos etanólico y acuoso de hojas que mostraron actividad frente a C. albicans donde emplearon el método de difusión en pozos de agar, como medio de cultivo el agar papa dextrosa y una concentración del inóculo de aproximadamente 105 UFC/mL [23].

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ISSN 1666-7948
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Revista QuímicaViva
Número 1, año 18, Abril 2019
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