ESPECTROSCOPÍA DE LAS INTERACCIONES DE DROGAS QUINOLÍNICAS ANTIMALÁRICAS CON Fe(III)PPIX

SPECTROSCOPY OF QUINOLINE ANTIMALARIALS DRUGS  INTERACTIONS  WITH Fe(III)PPIX

 

Yonathan Parra1*, Rosa E. Ferrer 1, Keyla Montero1 y Maritza Martínez2

 1 Departamento de Química. Facultad de Humanidades y Educación. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

2 Centro de Investigaciones en Química de los Productos Naturales. Facultad de Humanidades y Educación. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

 

*e-mail: yonathan.parra@hdes.luz.edu.ve

Recibido el 04/11/2011 - Aceptado el 13/11/2011

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RESUMEN

Los avances alcanzados con la aplicación de los diferentes métodos espectroscópicos han representado una de las armas fundamentales en el diseño racional de drogas, facilitando un mayor conocimiento de los blancos moleculares y detectando farmacóforos de moléculas líderes. A continuación se presenta una revisión en la cual se  exponen algunas de  las investigaciones  más relevantes de los últimos años que han permitido generar un diseño racional de compuestos antimaláricos, apoyados en la aplicación de los diferentes estudios espectroscópicos para la elucidación de las interacciones de drogas 4-aminoquinolínicas con la ferriprotoporfirina IX, principal blanco de estudio a nivel molecular; con el propósito de ofrecer una información básica a los investigadores en esta área que permita facilitar el planteamiento de metodologías para el diseño y evaluación de compuestos antimaláricos al estimar las ventajas y limitaciones de cada técnica espectroscópica.

 

Palabras Claves: Cloroquina, Ferriprotoporfirina IX, Interacción droga-porfirina, Métodos espectroscópicos, Malaria

 

ABSTRACT

The progress made with the application of different spectroscopic methods have represented one of the key weapons in the rational drug design, providing a better understanding of the molecular targets and detecting pharmacophore in leader molecules. Below is a review of some of the most relevant research in recent years which has allowed a rational design of antimalarial compounds, to be created by the application of different spectroscopic studies to elucidate interactions of 4-aminoquinoline drugs with ferriprotoporphyrin IX, which is main target of study at molecular level, in order to provide basic information for researchers in this area to facilitate the approach of methodologies for the design and evaluation of antimalarial compounds to estimate the benefits and limitations of each spectroscopic technique for this purpose.

 

Keywords: Chloroquine, Ferriprotoporphyrin IX, Porphyrin-drug interaction, Spectroscopy Methods, Malaria

 

1.        Introducción

Con la evolución que ha experimentado en la actualidad  el descubrimiento de nuevas drogas, apoyado en los avances científicos de áreas como la Biología Molecular, los Métodos espectroscópicos y la Simulación Asistida por Computación, la expresión “Química Medicinal Racional” adquiere una gran relevancia para el estudio del mecanismo de acción de nuevas drogas. El propósito de esta revisión es exponer las investigaciones en el área que han permitido generar un diseño racional de compuestos antimaláricos, enfocados principalmente en la importancia que han tenido los estudios espectroscópicos, con la finalidad de facilitar la búsqueda de datos a los investigadores, al momento de plantear una metodología para la evaluación de la actividad antimalárica, tomando como blanco a nivel molecular la ferriprotoporfirina IX (Fe(III)PPIX) y su dimero β-hematina. 

2.      Malaria. Importancia del estudio del Hemo como blanco molecular

La malaria o paludismo representa una de las infecciones parasitarias más devastadoras en humanos. Es producida por especies de protozoarios del género Plasmodium, siendo el Plasmodium falciparum la especie más letal. Este parásito se desarrolla a través de un complejo ciclo de vida que se da entre el vector mosquito hembra (ciclo esporogónico)  y el hospedador humano; en este último el parásito pasa por dos ciclos consecutivos. Un ciclo exoeritrocítico dentro de células hepáticas y un ciclo eritrocítico, infectando los glóbulos rojos y alimentándose de la hemoglobina del hospedador, a fin de obtener los aminoácidos necesarios para sintetizar sus propias proteínas (1, 2). Sin embargo, el hemo libre obtenido de la degradación de la hemoglobina, también conocido como hematina o hidroxiferriprotoporfirina IX (Figura 1a),  es muy tóxico debido a que puede generar especies reactivas de oxígeno como H2O2, radicales superóxido y radicales hidroxil que son mediadores directos de ciertos procesos bioquímicos que ocasionan la ruptura celular y en última instancia la muerte del parásito. Para superar la toxicidad del hemo libre, el parásito Plasmodium está equipado con sistemas de desintoxicación de hemo (1, 3, 4, 5, 6). Dichos sistemas se pueden dar dentro de la vacuola digestiva o en el citoplasma, convirtiendo al hemo tóxico en β-hematina/hemozoína (Figura 1b, 1c), no tóxica, a través de un mecanismo conocido como formación de hemozoína, considerado el mecanismo más importante para la desintoxicación del hemo libre en el plasmodium.  El mecanismo de formación de hemozoína no está muy claro, sin embargo, este proceso es generalmente aceptado como una biomineralización o biocristalización (1, 7). Aquí la formación de enlaces Fe-carboxilato y formación de cristales de β-hematina/hemozoína, a través de puentes de hidrógeno, se da simultáneamente. Es por ello que el estadío eritrocítico es el más estudiado para la búsqueda de blancos antimaláricos, en vista de la importancia del mismo para la supervivencia del parásito.

Conocido el efecto nocivo del hemo y el principal mecanismo de desintoxicación del parásito, se han ideado varios compuestos que interfieren en este proceso de protección.  En la lista de los compuestos inhibidores de la biomineralización de hemozoína se encuentra la cloroquina y compuestos relacionados, los cuales son objeto de estudio en esta revisión.

 

a

b

c

 

FIGURA 1: Estructura química de: a) Hematina b) β-hematina c) Hemozoína

 

3.        Caso de la cloroquina como molécula líder

La cloroquina (CQ) (Figura 2) es una 4-aminoquinolina que ha sido usada extensamente para el tratamiento de la malaria. Su sitio de acción es la vacuola alimenticia y debido a sus propiedades lipofílicas y débilmente básicas se encuentra en forma monocatiónica, a un pH de 7.4, en el citoplasma del eritrocito infectado atravesando la membrana de la vacuola como consecuencia de un gradiente de pH; dicho organelo se caracteriza por presentar un medio ácido, aproximadamente pH 5.5 (8), lo que genera la especie diprotonada de cloroquina (CQ2+) imposibilitando su salida a través de los canales de transporte por diferencias de carga (9), favoreciéndose su acumulación para intervenir en la inhibición de formación de hemozoína, generando las especies reactivas de oxígeno con propiedades oxidantes, lo que ocasiona la muerte del parásito (10, 11).

 

image001.jpg 

(-)-R-CQ

(+)-S-CQ

 

FIGURA 2: Enantiómeros de la Cloroquina.

 

Como se discutirá más adelante, la interacción π-π entre la cloroquina y el sistema electrónico de la hematina, gobierna la formación del aducto (12, 13). El hemo libre y el complejo CQ-hemo, al inducir el estrés oxidativo, pueden ocasionar la peroxidación de los lípidos de la membrana del parásito, daños al ADN, oxidación de proteínas y finalmente la eliminación del parásito (14).

Describiendo la relación entre las modificaciones estructurales y su función antimalárica, tenemos que los compuestos 7-halo sustituidos son los antimaláricos más activos en la serie de las 4-aminoquinolinas (15, 16). El cambio del halógeno o la disustitución sobre el núcleo quinolínico generalmente disminuye su actividad. Por otro lado, la separación internitrógeno, es decir, la distancia molecular entre el grupo amino en posición cuatro y el N-alquilamino afecta el nivel de actividad de las 4-aminoquinolinas y es importante en la determinación de la viabilidad de las drogas para restringir el hemo (17). Los núcleos 4-aminoquinolínicos, junto a la cadena lateral aminoalquílica de cloroquina, y antimaláricos relacionados son indispensables para la formación del complejo droga-hemo libre. Por otra parte, desde el punto de vista estereoquímico no se han evidenciado cambios en la actividad antimalárica cuando se comparan la acción de los enantiómeros de un compuesto 4-aminoquinolínicos (18). Entre las posibles hipótesis planteadas para explicar este hecho se encuentran, en primer lugar, que la membrana del parásito no contiene receptores enantioselectivos necesarios para limitar el acceso de estos compuestos al interior del citoplasma del Plasmodium, facilitándose la vía que toma la droga para llegar hasta su sitio de acción. En segundo lugar, se considera que de acuerdo con los modelos propuestos de interacción molecular entre CQ-hemo, no existen limitaciones respecto a las variaciones estereoquímicas, pero sin embargo, una variación en las posiciones y tipos de sustituyentes del núcleo quinolínico si afecta significativamente dicha interacción.

4.      Espectroscopía del receptor, fármaco y sus interacciones

Debido a que el hemo es considerado el blanco molecular de las drogas 4-aminoquinolínicas, se han desarrollado varias investigaciones con el propósito de tener un conocimiento más claro acerca de la naturaleza de las interacciones existentes entre droga y blanco, para promover una síntesis racional de fármacos antimaláricos. Por lo tanto, empleando los recursos disponibles en la literatura inicialmente se presentarán, para cada región, las características espectrales individuales de las especies químicas en estudio (cloroquina y Fe(III)PPIX), previa interacción de las mismas, con el fin de facilitar la interpretación y discusión de los cambios  producidos en el espectro al medir el complejo CQ-Fe(III)PPIX, apoyados en las investigaciones relacionadas con este campo.

I.- ESPECTROSCOPÍA UV-VISIBLE

1.        Características espectrales individuales en el UV-visible

El hemo o Fe(III)PPIX corresponde a una metaloporfirina cuyo núcleo cíclico es planar, con 22 electrones π, y que de acuerdo  a la regla de Huckel de aromaticidad (4n+2 electrones π deslocalizados, donde n=4) 18 electrones están deslocalizados entre 16 átomos del macrociclo  (Figura 3).

 image003.jpg

FIGURA 3: Deslocalización de electrones π  en porfirinas.

 

Debido a la gran circulación de electrones en el anillo porfirínico altamente conjugado las metaloporfirinas absorben en la región UV-visible, razón por la cual es considerado un cromóforo aromático, mostrando espectros característicos de tres bandas llamadas bandas Soret (γ) y Q (α y β)  (Figura 4).

image005.jpg

FIGURA 4: Espectro UV-visible de metaloporfirinas (43).

 

Las bandas espectrales pueden explicarse apoyándose, en primer lugar, en la teoría de grupos la cual plantea que las metaloporfirinas tienen una geometría D4h donde sólo son posibles los orbitales a1u, a2u, b1u, b2u y eg (19); en segundo lugar, en el modelo de Gouterman de los cuatro orbitales moleculares π donde se propone transiciones de electrones desde el HOMO, π de la porfirina, al LUMO π* (Figura 5a),  cuya diferencia de energía es lo suficientemente pequeña para generar bandas de absorción  en la región del visible y ultravioleta cercano del espectro (20). Cálculos de tipo Huckel demuestran que el orbital a2u tiene mayor energía que el orbital a1u. Por ello a la banda Soret (entre 400-430 nm) se asignan transiciones a1ueg y a las bandas Q (entre 500-700 nm) transiciones a2ueg (Figura 5b). Según el modelo de Gouterman las bandas Q en metaloporfirinas no son debidas a diferentes transiciones electrónicas sino que se encuentran asociadas a niveles vibracionales 0 → 0 y 0 → 1 de una transición monoelectrónica (21).

 

image007.jpg

FIGURA 5: a) Modelo de Gouterman, b) Diagrama energético de una porfirina. Adaptación del modelo y diagrama presentado por Zerner y col (44).

 

Respecto a la espectroscopía del fármaco cloroquina, el responsable de la absorción en esta región, es el anillo quinolínico, el cual es isoelectrónico con el hidrocarburo aromático naftaleno, debido a que el heteroátomo aporta dos electrones a la nube π del sistema, razón que justifica que la quinolina y cloroquina presenten espectros UV-visibles semejantes al naftaleno (Tabla 1). Por tanto, el espectro de la cloroquina se caracteriza por la presencia de tres bandas de absorción de origen π → π*, las cuales han recibido diferentes denominaciones, en nuestro caso utilizaremos las bandas E y B (Figura 6) (22).  La banda E1 es la más intensa (ε mayor) y puede observarse en el UV cercano debido a la extensa conjugación del anillo en la cloroquina. La banda E2 (ε intermedio), de intensidad media, presenta carácter de transferencia de carga con el sustituyente, propiedad que puede utilizarse, para medir en medio ácido la capacidad de resonancia entre el par de electrones no compartidos del nitrógeno en posición cuatro con el sistema π del anillo quinolínico.  La banda B, depende de la simetría de la molécula, y su presencia en el espectro se debe a la reducción de simetría por movimiento vibracional por lo que muestra una estructura fina vibracional característica. Sin embargo, la banda B de la cloroquina tal como se observa en la Figura 6 muestra pérdida de dicha estructura como consecuencia de la conjugación n−π del átomo de nitrógeno, en posición cuatro, con el sistema aromático. Esta banda (al igual que las otras) se desplaza batocrómicamente cuando el anillo quinolínico es sustituido por auxocromos, como por ejemplo el Cloro, siendo observables en el UV cercano. La baja intensidad de la banda B se debe a que la transición es prohibida por simetría (naftaleno: εmax = 280), sin embargo, la banda se intensifica cuando se reduce la simetría del sistema π por interacción con un auxocromo (cloroquinaεmax = 16000 y 15500).

 

TABLA 1

Bandas características del espectro UV-VIS del naftaleno y compuestos isoelectrónicos

Compuesto

Banda E1

Banda E2

Banda B

l

e

l

e

l

e

Naftaleno

221

100000

286

9300

312

280

Quinolina

228

40000

270

3162

315

2500

Cloroquina

222

-

258

-

332

y

334

16000

y

15500

l está expresada en nanómetros

 

Debido a que ambas especies (fármaco y receptor) son mutuamente excluyentes, respecto a las zonas de absorción, generalmente los estudios de sus interacciones se llevan a cabo midiendo los cambios espectrales de la Fe(III)PPIX (región visible) al adicionar ciertas cantidades de cloroquina.

image009.jpg

FIGURA 6: Espectro UV de la cloroquina (CQ) a pH 7.3. (+)-CQ 1 X 10-4  M; NaCl  0,1 M. Longitud de trayecto óptico 0,2 cm. Medida 30 min después de preparada la solución. Adaptado de Blauer G y col (18).

 

2.        Características espectrales UV-visible después de la interacción

Las variaciones de las principales características de las bandas de absorción de los espectros de la Fe(III)PPIX se muestran en la figura 7:

a.- En la anchura de las bandas de absorción: Esta propiedad se ha relacionado con el fenómeno de dimerización, ya que depende principalmente del número de componentes vibracionales de la transición correspondiente. Si se compara la banda Soret de los espectros mostrados en las figuras 7a y 7c se puede observar una gran diferencia en la anchura, la cual se debe a que en DMSO acuoso la Fe(III)PPIX se encuentra bajo la forma de monómero mientras que en soluciones acuosas diluidas o agua pura la Fe(III)PPIX existe como dímero, esta última forma parece ser la responsable del enmascaramiento del efecto hipocrómico en la banda Soret en medios puramente acuosos.

b.- En cuanto a la posición de las bandas: En la zona de transferencia de carga o banda Q (Figura 7b) se observa un desplazamiento desde 623nm hasta 596nm (desplazamiento hipsocrómico). En la banda Soret (Figura 7c) se observa un desdoblamiento en dos bandas, a longitudes de onda más cortas, aproximadamente de igual intensidad con máximos entre 344-346nm y 390-392nm, respectivamente. Esto puede deberse a que como la longitud del complejo CQ-Fe(III)PPIX es más pequeña que la longitud de onda de la radiación, la oscilación del campo eléctrico del fotón puede simultáneamente interactuar con los electrones de ambas moléculas, generando en cada una un momento dipolar de transición (reordenamiento de cargas durante la transición), los cuales si son adecuadamente alineados pueden dar lugar a un acoplamiento excitónico, de manera que no podemos saber cuál es el cromóforo excitado, y por consiguiente genera un desdoblamiento de banda (23, 24).

c.- En la intensidad de las bandas: en la región del UV cercano (Figuras 7a y 7c) la banda Soret del aducto CQ-Fe(III)PPIX muestra una notable disminución de la absorbancia (efecto hipocrómico), por tal razón, la banda Soret es altamente valorable en la detección y monitorización de interacciones. Tal disminución en la intensidad de banda en la Fe(III)PPIX parece ser el resultado de momentos dipolares inducidos en la cloroquina (25), ocasionando transiciones con pequeños cambios en la banda Q. En contraste, en la región del visible (Figuras 7b y 7d) se observa aumento en la intensidad de banda (efecto hipercrómico). Específicamente la región visible del aducto CQ-Fe(III)PPIX (Figura 7d) muestra un máximo pronunciado alrededor de 600nm, en comparación con el espectro Fe(III)PPIX aislada, el cual muestra un espectro difuso, con una significativa disminución de la absorbancia en dicha región.

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FIGURA 7: Efectos de la adición de cloroquina sobre el espectro de absorción de ferriprotoporfirina IX en DMSO acuoso al 40%, pH=7.5 (A y B) y NaCl acuoso al 0.1M, pH=7.3 (C y D). En cada espectro, a y FP es ferriprotoporfirina IX en ausencia de cloroquina, b y FP-CQ es ferriprotoporfirina IX en presencia de cloroquina. A y B muestra los cambios después de consecutivas adiciones de cloroquina mientras que C y D tras una única adición (18,23).

 

Basados en estos cambios espectrales, se considera que puedan estar implicados dos posibles procesos: que la adición de cloroquina induzca agregación de Fe(III)PPIX o que los cambios reflejan asociación de la cloroquina con la Fe(III)PPIX. Mientras una gran disminución en la absorbancia de la banda Soret es frecuentemente un indicador de agregración, también puede ser causada por formación de complejos π−π (donador−aceptor). Por tanto, el fuerte hipocromismo observado, por formación del complejo no covalente, permite sugerir que los planos moleculares están apilados aproximadamente en paralelo y en cercana proximidad, tal como se ha evidenciado en otros estudios basados en el empleo de simulación asistida por computación (23, 26).

A pesar de que esta región del espectro permite detectar interacciones no da información de cuáles átomos específicamente están involucrados, por esta limitación de la región espectroscópica UV-visible se hace necesario emplear otras técnicas espectroscópicas que ayuden a obtener mayor información acerca de la interacción droga- hemo y que permitan elucidar con mayor efectividad el mecanismo de inhibición de la formación de β-hematina/hemozoína por drogas 4-aminoquinolínicas como la cloroquina.

 

II. ESPECTROSCOPÍA DEL INFRARROJO

1.        Características espectrales individuales en el infrarrojo

A pesar de que el modelo de hemozoína mostrado en la Figura 1c no derivó directamente de los estudios realizados por Slater y col (27), se emplea los espectros infrarrojos resultantes de su investigación en conjunto con la estructura de hemozoína propuesta por Pagola y col (28), debido a que se mantiene una estrecha relación estructura-espectro. El espectro obtenido para la hemozoína es significativamente diferente al de la hematina (Figura 8a) pero idéntico a la β-hematina sintética (Figura 8b), un dímero cíclico de Fe(III)PPIX. Por tanto, si se considera adicionalmente la composición elemental (Tabla 2) de ambas especies (β-hematina/hemozoína) se puede asegurar que son química y estructuralmente idénticas (29).

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FIGURA 8: Espectros IR por trasformada de Fourier. (a) hemozoína (−) y hematina (---). (b) hemozoína (−) y β-hematina () (27).

TABLA 2

Composición elemental de hemozoína y b-hematina

Elementos

Porcentaje de masa

Hemozoína

b-hematina

Hematina

(Teórico)

Carbono

63,7

64,7

64,5

Hidrógeno

5,6

5,0

5,3

Nitrógeno

7,5

8,7

8,8

Hierro

7,5

8,3

8,8

Cloro

< 0,1

< 0,3

-

Oxígeno*

15,6

13,3

12,6

*Como no se puede llevar a cabo un análisis de oxígeno en cantidades significativas de hierro, los valores de oxígeno reportado representa el porcentaje en masa remanente

 

El espectro de la hemozoína está claramente más resuelto que el de hematina debido a una reducción de puentes de hidrógeno intermoleculares y contiene señales a 1664 cm-1 y 1211 cm-1. Una posible estructura para la hemozoína, que explique su insolubilidad y su espectro IR, es una coordinación directa entre un carboxilato de un hemo y el hierro del otro, formando un polímero lineal (27). Sin embargo, en la actualidad la estructura molecular de la hemozoína se acepta como un dímero centrosimétrico (28). Sea un polímero lineal o un dímero centrosimétrico, es posible observar dos coordinaciones: unidentada o quelato simétrico como consecuencia de que uno o dos de los oxígenos del grupo carboxilato se coordinen con el metal, respectivamente (27). Cuando la coordinación es unidentada, uno de los enlaces C−O se comporta con carácter de doble enlace y por consiguiente da lugar a absorciones de alargamiento C=O entre 1700 y 1600 cm-1. Por tanto, en el espectro IR de la β-hematina/hemozoína el pico intenso a 1664 cm-1 (ausente en el espectro de la hematina) sugiere la presencia de una coordinación carboxilato unidentado sobre el hierro. La otra banda intensa en el espectro de la β-hematina/hemozoína a 1211 cm-1 se debe a alargamientos C-O de grupos carboxilatos en posición axial (27). Por otra parte, Stoilova y col (30), demostraron que los acetatos monodentados presentan tres bandas de poca intensidad, correspondientes a la deformación C-O entre 920 y 720 cm-1, las cuales están presentes en el espectro IR de la β-hematina/hemozoína, confirmando el tipo de coordinación metal-carboxilato.

2.        Características espectrales en el infrarrojo después de la interacción

Debido a que las absorciones a 1664 y 1211 cm-1 son características de la hemozoína, se considera que la región entre 1800 y 1200 cm-1 es la más importante para evaluar la asociación fármaco-receptor. La adición de tres equivalentes de cloroquina a β-hematina, produce una inhibición de la formación espontanea del pigmento malárico (Figura 9a). Por otra parte, esta droga y sus análogas inhiben la formación de β-hematina en tiempos de incubación relativamente cortos (Figura 9b), lo cual sugiere que la acción de las 4-aminoquinolinas está más dirigida a la disminución de la tasa de formación de hemozoína que a un bloqueo irreversible de su formación. Todo esto indica que las interacciones CQ-Fe(III)PPIX siguen un mecanismo de unión reversible (16), porque al aumentar el periodo de incubación vuelven a aparecer las bandas a 1664 cm.1 y 1211 cm.1,  en la que participan interacciones más débiles que las existentes entre Fe(III)PPIX-Fe(III)PPIX (Tabla 3). Las fuerzas que mantienen unidos ambos tipos de complejos son los enlaces químicos u otras interacciones atractivas, que producen el máximo acoplamiento estereoelectrónico. La interpretación de los cambios espectrales en el infrarrojo sugiere adicionalmente que las fuerzas intermoleculares que operan en las interacciones CQ-Fe(III)PPIX son fuerzas basadas en la entropía, de tipo hidrófobas, y fuerzas no polares, de tipo dispersión de London, entre los orbitales π de los núcleos aromáticos planos de la cloroquina y Fe(III)PPIX, las cuales son decisivas para la formación del complejo. Esto es consistente con estudios de estructura-actividad que indican que la presencia de un grupo amino donador de electrones en la posición 4 es crítica para la fuerte asociación de aminoquinolinas con hematina (17).

 

TABLA 3

Aspectos fisicoquímicos relacionados con la interacción fármaco-receptor

Interacciones

Producto

Mecanismo

Equilibrio

Hematina-hematina

b-hematina

Termodinámico

Irreversible

4-aminoquinolinas- hematina (o b-hematina)

Complejo fármaco-receptor

Cinético

Reversible

Tabla construida en base a los datos reportados por Egan y Ncokazi (13).

En complemento a los estudios espectroscópicos se han realizado diálisis en equilibrio, determinándose que la afinidad de la cloroquina por la Fe(III)PPIX es alta y que el complejo contiene 2 moles de hemo por mol de cloroquina (31). Sin embargo, en búsqueda de un mayor conocimiento acerca de la estructura del complejo CQ-Fe(III)PPIX se han realizado estudios con resonancia magnética nuclear que han permitido proponer algunos modelos de asociación fármaco-receptor.

IR POR TIEMPOS DE INCUBACION

FIGURA 9: Espectros infrarrojos obtenidos en presencia de 3 equivalentes de cloroquina. (A) in situ. Las flechas indican las posiciones donde aparecen los picos de β-hematina y los círculos llenos los picos debido a asociación droga-hematina. (B) después de 1, 6 y 24 h de incubación (líneas fina, media y gruesa, respectivamente). Las líneas verticales marcan las posiciones de las bandas más prominentes esperadas para β-hematina a 1660 y 1210 cm-1 (13).

 

III. ESPECTROSCOPÍA DE RMN

1. Características espectrales individuales en RMN 1H

La aplicabilidad de esta técnica para el estudio de las interacciones fármaco-receptor se basa en las pequeñas diferencias que pueden observarse entre los desplazamientos químicos de ciertos átomos del fármaco, después de incubarlo con la macromolécula receptora. Los espectros RMN 1H de la cloroquina y Fe(III)PPIX difieren enormemente en sus señales con desplazamientos químicos a campo alto y bajo, respectivamente. En otras palabras, no hay superposición de las señales del fármaco con las de la macromolécula receptora, condición indispensable para su estudio a través de RMN.

Los desplazamientos químicos observados en los espectros de resonancia magnética protónica de la cloroquina se modifican en forma drástica según el solvente empleado, justificado por un proceso de auto-asociación del fármaco. El espectro de la cloroquina, disuelta en DMSO (Figura 10), permite obtener los valores de desplazamiento químico y multiplicidad de las señales para la mayoría de los protones (Tabla 4).

FIGURA 10: Espectros RMN 1H cloroquina (10-2 M) en DMSO. Referencia interna TMS.

 

TABLA 4

Valores de los desplazamientos químicos de los protones de la cloroquina

(10-2 M, DMSO) y multiplicidad de las señales

Tipo de 1H

d (ppm)

Multiplicidad de las señales

Aromáticos

 

 

H2

8,3760

Doblete

H5

8,3432

Doblete

H8

7,7857

Singlete

H6

7,7520

Doblete

H3

6,5205

Doblete

Cadena Alifática lateral

 

 

H11

3,7273

Singlete

H16-18

2,3928

Cuadruplete

H13-14

1,4891

Multiplete

H12

1,2434

Doblete

H17-19

0,9037

Triplete

Los datos empleados en esta tabla se tomaron de los valores reportados por Moreau y col (32).

 

Respecto al núcleo quinolínico, nótese que los protones cercanos al átomo de cloro en posición 7, aparecen a desplazamientos químicos diferentes, según el orden H5 > H8 > H6, debido a que el halógeno unido directamente al sistema aromático posee orbitales con electrones libres que pueden solaparse con los orbitales del sistema π   aromático, cediendo temporalmente estos electrones por efecto de resonancia, resultando más intenso el efecto donador que el atrayente y apantallando en mayor medida los protones en posición orto, siendo más pronunciado para el H6, que por acoplamiento con el H5, aumenta dicha protección apareciendo a campo más alto que el H8. Por otra parte, los protones H2 y H3 están sometidos al efecto electroatrayente del átomo de nitrógeno endocíclico, fuertemente marcado para el H2, justificando su aparición a campo más bajo (δ alto) comparado con el resto de los protones del sistema anular.

Respecto a la cadena lateral, el H11 aparece a campo bajo (δ alto) como consecuencia del efecto inductivo ejercido por el átomo de nitrógeno en posición 4, los protones H13, H14 y H15 están extensamente acoplados produciendo señales anchas y distorsionadas de poca intensidad, el protón H12 surge como un doblete debido a su acoplamiento con el H11. Las señales de mayor importancia corresponden a los protones H16-18 y H17-19, que por ser química y magnéticamente equivalentes aparecen con igual desplazamiento químico. Estos últimos, junto al H11 son considerados como referencia para el análisis espectral de las interacciones CQ:Fe(III)PPIX.

Los desplazamientos químicos obtenidos para la cloroquina, disuelta en agua, son menores para todos los protones (32, 33). En otras palabras, las señales aparecen a campo alto (Tabla 5), lo cual se explica si la cloroquina está asociada como un dímero en medio acuoso (Figura 11), este tipo de asociación por fuerzas hidrófobas modifica el efecto de corriente anular sobre ambos sistemas aromáticos debido al acoplamiento π-π, donde los electrones estarán menos sometidos a la circulación bajo el efecto del campo magnético aplicado, generándose un campo magnético inducido menor, por tanto, los núcleos resonantes del anillo estarán débilmente desprotegidos, apareciendo a campo alto y a un desplazamiento bajo con respecto a los observados en DMSO. Para el caso de los protones de la cadena alifática, se observa que a mayor distancia del sistema conjugado acoplado la desprotección es menos eficiente, lo cual se comprende si se asume que dicha cadena adopta una disposición espacial tal, que se aleja del sistema coplanar, ubicándose así en la zona de protección del cono anisotrópico. Por tanto, sus señales aparecen inclusive a frecuencias menores (campo alto) que el TMS.

image019.jpg

FIGURA 11: Modelo de asociación de la Cloroquina (32).

 TABLA 5

Valores de los desplazamientos químicos de los protones de la cloroquina

(10-2 M, buffer de fosfato 0,1 M pH = 7)

Tipo de 1H

d (ppm)

Aromáticos

 

H2

4,5393

H5

4,4142

H8

4,0775

H6

3,8243

H3

3,0797

Cadena Alifática lateral

 

H11

0,3730

H16-18

-0,5785

H13-14

-1,9318

H12

-2,3391

H17-19

-2,5187

Los datos empleados en esta tabla se tomaron de los valores reportados por Moreau y col (32).

 

El espectro de RMN 1H de la Fe(III)PPIX (Figura 12), muestra notables diferencias con respecto a los espectros de la mayoría de las sustancias orgánicas. El anillo tetrapirrólico de la porfirina posee como átomo central el ion Fe3+, de alto espín (S = 5/2), con electrones desapareados en el orbital d (paramagnético), el cual es responsable de alterar significativamente el campo magnético observado por los núcleos resonantes de la molécula, comparado con un sistema diamagnético (Figura 13). Como consecuencia, la relajación longitudinal, transversal y los desplazamientos químicos, se ven muy afectados (34).

image021.jpg

FIGURA 12: Espectros RMN 1H de Ferriprotoporfirina IX acuosa. Las asignaciones tentativas de los picos son: i grupos metil, ii α-CH vinil y α-CH2 propionil y iii cis y trans β-CH2 vinil y β-CH2 propionil. Los asteriscos indican señales del solvente.

 

image024.gif

FIGURA 13: Momento magnético originado por el spin electrónico, S, en un campo magnético, B0. El núcleo resonante ve modificado sus parámetros de RMN debido a la presencia de electrones desapareados en el ión metálico.

 

El cómo afecta las interacciones espín electrónico-núcleo resonante (S-I), a los parámetros en RMN es una discusión de gran relevancia. En primer lugar, el principal factor que determina la observación de los protones de la Fe(III)PPIX  paramagnética es el tiempo de relajación electrónica del ion Fe3+, tS. Como los electrones se relajan mucho más rápidamente que los núcleos, el electrón le está proporcionando al núcleo una fuente continua de relajación adicional mucho más eficiente e intensa que otro mecanismo. En consecuencia, los núcleos que observan electrones desapareados poseen tiempos de relajación T1 y T2, mucho más cortos que los que poseerían en ausencia de ese efecto paramagnético. Si el electrón se relaja muy rápidamente (<tS), el efecto sobre los núcleos resonantes cercanos se verá disminuido, aumentando el tiempo de relajación nuclear que favorece la observación de señales estrechas, por ejemplo, el ion Fe3+ de bajo espín (S = ½), con tS = 10-11- 10-13 s. En caso contrario, si el electrón relaja muy lentamente (>tS), el efecto sobre los núcleos resonantes cercanos será mayor, disminuyendo el tiempo de relajación nuclear y en consecuencia generando señales anchas y difíciles de observar, este caso es característico del ion Fe3+ presente en la porfirina del grupo hemo, el cual posee tS = 10-9- 10-11 s. En definitiva, la velocidad de relajación electrónica será la que regule las velocidades de relajación de los núcleos resonantes y, estos últimos determinan las señales observadas en el espectro, que en caso extremo, pueden incluso no observarse (35). En segundo lugar, los desplazamientos químicos inusuales observados en el espectro de la Fe(III)PPIX, se deben a la suma de dos contribuciones, la debida al desplazamiento químico de los protones en ausencia del efecto paramagnético (δdia), y en presencia de éste, por acoplamiento entre los electrones desapareados y el núcleo resonante (δpara). Esta última contribución se conoce como desplazamiento hiperfino. Según Bertini y col (34), dicho desplazamiento puede surgir de dos tipos de interacciones, a saber:

a.- Interacciones de Fermi o de contacto (δcon), que se produce a través de enlaces químicos por mecanismos de transferencia de densidad electrónica directa o polarización de espín, este tipo de interacción generalmente deja de ser operativo para más de cuatro enlaces y las señales suelen aparecer con δ superiores a los 20 ppm.

b.- Interacciones dipolares o de pseudocontacto (δpc), donde el electrón genera un momento magnético con una determinada orientación espacial respecto a la estructura de la molécula, e interacciona  a través del espacio, por el mecanismo de acoplamiento dipolar, con el momento magnético del núcleo resonante. La magnitud de esta contribución es generalmente inferior a la contribución de contacto, por tal razón, los protones con contribución exclusiva de pseudocontacto aparecen a campo muy alto (δ = -20, -10 ppm). Esta región del espectro se conoce como “zona pseudo-diamagnética”.

Con base en esta información, se puede justificar la extensión en los desplazamientos químicos del espectro RMN 1H de la Fe(III)PPIX, donde los grupos metil, α-CH vinil y α-CH2 propionil, por encontrarse a cuatros enlaces del ion Fe3+, predomina la interacción de contacto determinando así el desplazamiento hiperfino de dichos átomos.    

2. Características espectrales en RMN 1H después de la interacción

La interpretación de los espectros permite obtener una valiosa información para elucidar la posible estructura del complejo macromolecular CQ:Fe(III)PPIX, lo que conduce a sugerir la topología del receptor y su conformación farmacófora, para luego diseñar nuevas moléculas activas u optimizar la actividad farmacológica de las existentes.

En este sentido, para acceder de una forma sistematizada a dicha información, por lo general se evalúan las posiciones y anchuras de las señales generadas después de la adición de la molécula receptora, es decir, hemina y hematina, disueltas en DMSO y agua deuterada, respectivamente. La Tabla 6 muestra los valores de los desplazamientos químicos para los protones más afectados durante la interacción y que son fácilmente identificables, demostrándose varios fenómenos según el solvente empleado (36).

TABLA 6

Variación de los desplazamientos químicos de los protones más afectados de la cloroquina (10-2 M) en función de la agregación del receptor

Hemina (DMSO)

Protones

H11

H16-18

H12

H17-19

0

3,7273

2,3928

1,2434

0,9037

2,5X10-4

3,7273

2,4080

1,2434

0,9098

5X10-4

3,7364

2,4232

1,2404

0,9128

7,5X10-4

3,7303

2,4323

1,2404

0,9159

1X10-3

3,7303

2,4505

1,2404

0,9219

Dd = d10-3 - d0

0,003

0,0577

-0,003

0,0182

Hematina (D2O)

 

0

0,3730

-0,5785

-2,3391

-2,5187

10-4

0,3851

-0,5792

-2,3542

-2,5187

2X10-4

0,3669

-0,5800

-2,5314

-2,5187

3X10-4

0,3684

-0,5815

-2,3587

-2,5202

4X10-4

0,3624

-0,5822

-2,3625

-2,5202

5X10-4

0,3609

-0,5830

-2,3632

-2,5217

7,5X10-4

0,3427

-0,5845

-2,3640

-2,5232

10-3

0,3351

-0,5883

-2,3731

-2,5248

Dd = d10-3 - d0

0,037

-0,0098

0,034

0,0061

Los datos empleados en esta tabla se tomaron de los valores reportados por Moreau y col (32).

 

En DMSO se observa un desplazamiento a campo bajo de los protones H16-18 y H17-19, lo cual se justifica mediante el efecto inductivo que resulta de la protonación parcial del nitrógeno del grupo dietilamino con las funciones ácidas de la Fe(III)PPIX. En esta fase, los protones H11, H12 y los pertenecientes al núcleo quinolínico (valores no mostrados) no presentan desplazamientos significativos, siendo coherente con el hecho de que la porfirina en solución diluida de DMSO se encuentra bajo la forma de monómero solvatado. Dicha solvatación moviliza el ion Fe3+ paramagnético fuera del plano del sistema tetrapirrólico, evitando así los efectos de contribución de pseudocontacto (δ a campo alto) hacia el núcleo quinolínico. Además, mediante el estudio de las interacciones de cloroquina y protoporfirina IX (carente del metal) se demostró que no existe ningún tipo de enlace entre el átomo de hierro y el nitrógeno endocíclico.

En solución acuosa los efectos observados son contrarios a los encontrados en fase orgánica. En primer lugar, los desplazamientos químicos a campo alto para todos los protones de la cloroquina, se pueden explicar perfectamente si se consideran los estudios teóricos de acoplamiento (Docking) realizados en la pasada década (26, 37), los cuales muestran que la cloroquina se acopla lateralmente al sistema coordinado Fe3+-carboxilato del dímero de la β-hematina (Figura 14). En este modelo se observa que la interacción ocurre entre la zona central negativa del dímero de hematina (Fe3+-carboxilato) y el área de potencial positivo de la droga, correspondiente a la zona alrededor de la cadena alifática lateral. En consecuencia, los protones del anillo aromático planar de la cloroquina sufren con mayor intensidad los efectos de contribución de pseudocontacto generados por los electrones desapareados del metal, ocasionando que la variación de desplazamiento químico, Δδ, sea más marcada en relación con los demás protones de la molécula. El mismo efecto pero con menor intensidad se presenta para los protones de la cadena lateral, siendo poco detectable para los protones del grupo dietilamino terminal (más alejado del centro paramagnético), los cuales también están sometidos al efecto inductivo generado por la función ácida de la porfirina, en otras palabras, el grupo dietilamino está frente a un proceso de competencia de efectos, por un lado inductivo y por el otro de pseudocontacto. En segundo lugar, hay un ensanchamiento de las señales de algunos protones de la cloroquina a medida que aumenta la concentración de hematina, presentándose en mayor medida para los protones del anillo quinolínico, lo cual es compatible con un mayor tiempo de relajación electrónica, si recordamos que dichos núcleos resonantes están más cercanos al ion Fe3+ de alto espín, disminuyendo el tiempo de relajación de dichos núcleos y generando señales más anchas y de menor intensidad.

image025.jpg

FIGURA 14: Modelo de interacción cloroquina-β-hematina. A: Vista lateral. B: Vista superior (26).

 

Es importante señalar que en la bibliografía consultada se han encontrado varios modelos de interacción CQ:Fe(III)PPIX , como por ejemplo, el dímero μ-oxo (complejo 1:2 CQ:Fe(III)PPIX) (32), polímero lineal de hematina (27), polímero antiparalelo de hematina (4), dímero centrosimétrico de hematina (β-hematina) (28), modelo coplanar π-π con ligando axial orientado hacia fuera (38) y el dímero μ-oxo (complejo 2:4 CQ:Fe(III)PPIX), propuesto en algunas investigaciones (37). Sin embargo, el modelo de β-hematina ha sido mayormente aceptado por la comunidad científica y es el que mejor se adapta para justificar muchos de los resultados de las investigaciones consultadas en esta área, sin dejar de considerar los estudios que proponen que los agregados de hematina generados dependerán del control de condiciones experimentales y que probablemente la formación del dimero µ-oxo se genere (4, 39, 40), a pesar de no existir evidencias de su formación espontánea, pero sí posterior a la interacción de hemina con ciertos derivados quinolínicos (41).

En virtud de lo comentado en el párrafo anterior, se mostrarán los espectros de masas encontrados en la literatura que justifican adicionalmente el porqué se considera al modelo de β-hematina y al de la interacción mostrada en la Figura 14 como el más viable.

 IV. ESPECTROMETRÍA DE MASA

Espectros de masas del complejo CQ:Fe(III)PPIX

Antes de discutir las características de los espectros de masas resulta conveniente mencionar que en este apartado sólo se evaluarán los picos de los fragmentos originados después de la interacción fármaco-receptor, con base en lo reportado por Dascombe y col (42). Tomando en consideración los resultados antes expuestos, donde se propone que todas las fuerzas que intervienen en el complejo, tanto las debidas al dímero de hematina como las que favorecen el acoplamiento del fármaco con dicho dímero, son exclusivamente de tipo electrostáticas, lo que conduce entonces a un equilibrio entre las especies químicas aisladas y acopladas. En consecuencia, los fragmentos derivados de estas unidades químicas siguen apareciendo después de la interacción con algunos cambios en la intensidad.

La baja solubilidad de las 4-aminoquinolinas en solventes comunes, como DMSO y agua, limita en cierta medida algunos análisis químicos; sin embargo, previo al proceso de disolución, dichas quinolinas se someten a una agitación mecánica directa (síntesis mecanoquímica) en presencia de hemina, formando aductos similares a los producidos en solución que pueden disolverse posteriormente en solventes próticos, por ejemplo, metanol húmedo para posteriormente proceder a la identificación con exactitud mediante espectrometría de masas de alta resolución.

Los espectros de masas  (Figuras 15a y 15c) permiten cuantificar la estequiometría del complejo así como identificar el estado en que se encuentra la Fe(III)PPIX (μ-oxo o β-hematina). Por tanto, en el espectro A se observa un pico base a 616.1720 m/z, interpretado como un catión radical generado a partir de la pérdida del cloruro de la hemina encontrado en complejos con cloroquina en presencia de metanol como solvente. La formación del dímero de hemozoína es consistente con el pico a 1231.3767 m/z en el espectro B y C.

 

Espectro de masa A (Sin fondo)

Espectro de masa B (Sin fondo)

Espectro de masa C (Sin fondo)

 

FIGURA 15: Espectros de masas de los complejos CQ:Hemina. A) 2CQ:1H. B) Ampliación de la región de 1180-1360 m/z del espectro A. C) 1CQ:2H (42).

 

Mientras que la señal a 1248.3495 m/z correspondiente al dímero µ-oxo no se refleja en ningún espectro, indicando entonces la ausencia de tal especie en el proceso de interacción con la droga, según las condiciones estudiadas. El pico a 320.1877 m/z (Figura 15c) concuerda con el ión de la cloroquina. Por último, la relación estequiométrica droga-receptor se determina con más exactitud en comparación con otras técnicas espectroscópicas aunque su detección se hace un poco difícil debido al alto peso molecular del complejo, lo cual conduce a picos menos pronunciados. Sin embargo, Dascombe y col (42) lograron evidenciar el ión 1256.767 m/z asignado al complejo 2CQ:Hemina+ y un pico a 1552.8646 m/z asignado al complejo CQ:2Hemina+, más intenso y de mayor estabilidad a pesar de no ser observados en los espectros mostrados debido a su baja resolución. En la Figura 16 se muestran los posibles fragmentos que originan los espectros de masa discutidos.

image029.jpg

FIGURA 16: Posibles fragmentos iónicos detectados en los espectros de masas para complejos CQ:FPPIX. Adaptado de los resultados encontrados por Dascombe y col (42).

 

Finalmente, con el propósito de precisar los aportes que las diferentes investigaciones discutidas con anterioridad han aportado a la elucidación de la estructura del complejo CQ-Fe(III)PPIX, gracias a la contribución de las diferentes técnicas espectroscópicas, se pueden destacar los siguientes aspectos:

a.- El fuerte hipocromismo en la región UV-visible permitió sugerir la formación de complejos π-π (donor−aceptor), donde los planos moleculares están acoplados en paralelo y en cercana proximidad.

b.- Los estudios en infrarrojo corroboran las interacciones antes señaladas y, adicionalmente sugieren la existencia de una coordinación unidentada entre un carboxilato de una porfirina y el átomo de hierro de la otra, formando la  β-hematina.

c.- Las interpretaciones de los espectros de RMN 1H ha facilitado el estudio del posible complejo formado cuando las 4-aminoquinolinas activas, en este caso, cloroquina, ingresan a la vacuola digestiva del parásito e interacciona lateralmente al sistema coordinado Fe3+-carboxilato del dímero de la β-hematina.

d.- Los estudios de espectroscopía de masa analizados en esta revisión sugieren, una estequiometría 1:2 del complejo fármaco-receptor y que dicho complejo está formado por unidades de β-hematina y no del dímero μ-oxo.

 

CONCLUSIÓN

En la actualidad no existe un modelo de acoplamiento CQ:Fe(III)PPIX que sea definitivo e irrevocable, debido a la complejidad  que existe no sólo en la naturaleza de la interacción fármaco-receptor, sino también a la naturaleza de la interacción de la luz y el complejo formado.  No obstante, no se puede menospreciar el avance que se ha dado en este campo gracias a las facilidades que aportan las diferentes técnicas espectroscópicas, las cuales representan uno de los pilares fundamentales para el perfeccionamiento del diseño racional de fármacos.

 

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Revista QuímicaViva
Número 3, año 10, Diciembre de 2011
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