Marcadores sistémicos de peroxidación lipídica en ratas Sprague Dawley tratadas con Lipofundin 20%.

Livan Delgado Roche 1*, Ángela Fraga Pérez 2, María A, Bécquer Viart 2, Eduardo Fernández-Sánchez 2, Ana M. Vázquez López 3.

 

1 Laboratorio de Bioquímica, Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas, Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba.

2 Laboratorio de Farmacocinética, Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas, Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba.

3 Departamento de Ingeniería de Anticuerpos, Centro de Inmunología Molecular, La Habana, Cuba.

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Recibido el 28/07/2011 - Aceptado el 07/09/2011

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 Resumen

El fenómeno de la peroxidación lipídica está asociado al estrés oxidativo y las enfermedades crónicas de mayor incidencia a nivel mundial, como la aterosclerosis y los accidentes cerebrovasculares. El Lipofundin es una emulsión lipídica utilizada en la nutrición parenteral, pero también ha sido reconocido por su capacidad de inducir estrés oxidativo. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos del Lipofundin 20% sobre marcadores sistémicos de peroxidación lipídica en animales de experimentación. En el estudio se utilizaron ratas machos de la línea Sprague Dawley, las cuales fueron tratadas con una dosis de 2mL/kg de Lipofundin 20% durante 8 días consecutivos, la cual se administró por vía intravenosa. Al final del experimento se determinaron los niveles séricos de malonildialdehído, hidroperóxidos totales, 4-hidroxialquenales, así como el potencial de peroxidación y el perfil lipídico, a través de técnicas espectrofotométricas. Los resultados mostraron un incremento significativo (p<0,05) de la concentración de los marcadores de peroxidación lipídica en el grupo tratado respecto al grupo control. Además tuvo lugar una elevación significativa (p<0,05) de los niveles plasmáticos de colesterol total, triglicéridos, colesterol de LDL y de HDL. Pudimos concluir que el Lipofundin 20% provoca una marcada hiperlipidemia e induce fenómenos de peroxidación lipídica, lo cual puede contribuir a la instauración de un estrés oxidativo en estos animales.

Palabras claves: Peroxidación lipídica, lipofundin 20%, hiperlipidemia. 


 

Abstract

Lipid peroxidation phenomenon is associated to oxidative stress and chronic diseases of major incidence around the world, such as atherosclerosis and cerebrovascular accidents. Lipofundin is a lipid-rich emulsion which is used in parenteral nutrition, but also it has been rocognized by its capacity to induce oxidative stress. The aim of the present study was to evaluate the effects of Lipofundin 20% on systemic markers of lipid peroxidation in experimentation animals. Male Sprague Dawley rats were used in the study, which were treated with 2 mL/kg of Lipofundin daily during 8 days, administered intravenously. At the end of the experiment, the serum levels of malondialdehyde, total hydroperoxides, 4-hydroxyalkenals, the peroxidation Potential and the lipid profile were determined by spectrophotometric techniques. The results showed a significant increase (p<0.05) of lipid peroxidation markers in the treated animals respect to controls. Also, there was a significant increase (p<0.05) of total cholesterol, triglycerides, and LDL and HDL cholesterol. We concluded that Lipofundin 20% induces a hyperlipidemia and also lipid peroxidation phenomena, which may contribute to an oxidative stress instauration in these animals.

Key words: Lipid peroxidation, lipofundin 20%, hiperlipidemia.


 

Introducción

La peroxidación lipídica (POL) fue estudiada por primera vez en la década de los 30, en relación al deterioro de los alimentos, justo cuando el estudio sobre la química de las reacciones radicalarias tomaba especial relevancia. Con el avance del conocimiento acerca del papel de los radicales libres (RL) en la biología, la POL fue retomada como centro de atención y estudio en disciplinas como la biología, la química, la bioquímica y la nutrición. Estudios básicos demostraron que al igual que los ácidos nucleicos, los carbohidratos y las proteínas, los lípidos también podían ser atacados por los RL y ver afectada de esta manera sus estructuras y funciones (1).

La POL genera una serie de derivados tóxicos como los hidroperóxidos (ROOH), dienos conjugados (DC), malonildialdehído (MDA), 4-hidroxialquenales (4-HA), isoprostanos y los oxisteroles. El incremento de los niveles de estos productos ha sido asociado con una serie de estados fisiopatológicos de gran incidencia como las enfermedades cardiovasculares, especialmente la aterosclerosis (2).

El Lipofundin es una emulsión lipídica rica en aceite de soya y triglicéridos de cadena media, el cual se utiliza en la nutrición parenteral (3). Sin embargo su administración provoca estrés oxidativo en humanos y POL en especies animales como los conejos (4-6). Estos antecedentes condujeron a estudiar los efectos del Lipofundin, administrado por vía intravenosa, en ratas Sprague Dawley. Los resultados de la presente investigación demuestran que en estos animales se genera un estrés oxidativo, el cual está asociado al estado de hiperlipidemia que provoca la administración de Lipofundin al 20%. 

 

Materiales y Métodos

Reactivos

Todos los reactivos utilizados fueron de calidad para análisis, provenientes de la firma comercial Sigma-Aldrich (Sigma, St Louis, MO, EU).

Composición del Lipofundin 20%

El Lipofundin MCT/LCT 20% (Braun Melsungen AG, Melsungen, Alemania) es una emulsión lipídica que contiene: 100 g de aceite de soya, 100 g de triglicéridos de cadena media, 25 g de glicerol, 12 g de lecitina de huevo, 170 ± 40 mg de α-tocoferol y el vehículo oleato de sodio/agua para inyección cantidad suficiente para 1 L.

Animales

En el estudio fueron utilizadas 10 ratas macho de la línea Sprague Dawley con un peso comprendido entre 200-250 g. Estos animales provenientes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Bejucal, Mayabeque, Cuba) fueron mantenidos bajo condiciones controladas de temperatura (23 ± 2ºC) y humedad (50-70%), expuestos a ciclos de luz-oscuridad de 12 h y con libre acceso a los alimentos. Para llevar a cabo el experimento se obtuvo el consentimiento del Comité Institucional de Ética para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación y los procedimientos fueron conducidos de acuerdo a lo estipulado por dicha autoridad y por la Guía Europea para la Experimentación Animal. 

Diseño experimental

Los animales distribuyeron aleatoriamente en grupos de 5 animales cada uno. A las ratas del primer grupo (control) se les administró de manera intravenosa 2 mL/kg de solución fisiológica (NaCl 0,9%)  con el objetivo de someterlos al mismo estrés que a las del grupo tratado con Lipofundin. A estas últimas se les administró 2 mL/kg de Lipofundin 20% intravenosamente por una de las venas de la cola durante 8 días consecutivos.

Obtención de las muestras de suero

Los animales fueron anestesiados con Ketamina (5 mg/kg i.m.) y posteriormente se practicó la eutanasia de los mismos mediante una sobredosis de anestésico (pentobarbital sódico, 90 mg/kg, i.v.). (Abbott Lab, México SA de CV, México). Las muestras de sangre fueron obtenidas por punción a partir de la aorta abdominal e inmediatamente centrifugadas a 3.000 g durante 10 min a 4°C (Centrífuga JP Selecta, España). Los sueros fueron colectados, separados en los volúmenes requeridos para cada determinación y almacenados a -70°C hasta el momento del análisis.

Determinaciones bioquímicas

Todos los marcadores de óxido-reducción y del perfil lipídico fueron determinados a través de la utilización de métodos espectrofotométricos empleando un espectrofotómetro Pharmacia Biotech 1000 (Pharmacia LKB, Uppsala, Suiza), así como un sistema ultramicroanalítico de análisis (SUMA) (Centro de Inmunoensayos, La Habana, Cuba).

Hidroperóxidos totales

Para cuantificar la concentración de ROOH se utilizó el kit comercial Bioxytech H2O2-560 (Oxis International Inc., Portland, OR, EU). El ensayo se basa en la oxidación de Fe2+ a Fe3+ por los hidroperóxidos bajo condiciones de acidez. Los iones Fe3+ se unen al indicador xilenol naranja (3,3-bis(N,N-di(carboximetil)-aminometil)-o-cresolsulfona-ftalein, sal sódica), para formar un complejo coloreado estable que puede ser detectado a una longitud de onda de 560 nm.

Malonildialdehído y 4-hidroxialquenales

La concentración de MDA y 4-HA fue medida mediante la utilización del kit comercial LPO-586 obtenido de la firma Calbiochem (La Jolla, CA, EU). El ensayo se basa en la formación de un cromóforo estable luego de la incubación con el reactivo n-metil-2-fenil indol en medio ácido durante 40 min a 45°C detectable a 586 nm (7).

Potencial de peroxidación

Las muestras de suero fueron incubadas con una solución de sulfato de cobre II (2 mM) a 37°C durante 24 h. Posteriormente, se determinó el potencial de peroxidación (PP) restándole la concentración de MDA sin previa incubación a la concentración de MDA a las 24 h de incubación con el sulfato de cobre (8).

Perfil lipídico

Las concentraciones séricas de colesterol total (CT), triglicéridos (TG), colesterol de lipoproteínas de baja densidad (c-LDL) y el colesterol de lipoproteínas de alta densidad (c-HDL) fueron determinadas enzimáticamente mediante la utilización de un kit comercial proveniente de la firma Randox, Crumlin, Reino Unido.

Procesamiento estadístico

Fue realizado un análisis de homogeneidad de varianza mediante un ANOVA (Bartlett-Box), con el objetivo de conocer si la distribución de los valores experimentales se ajustaba a una distribución normal. Una vez comprobado esto, se utilizó la prueba t de student de dos colas para la comparación entre grupos. Los datos fueron expresados como la media ± desviación estándar (DE) y el nivel de significación estadística fue asumido como p<0,05 para todas las determinaciones. 

 

Resultados

En la Tabla 1 se muestra el efecto del Lipofundin 20% sobre la concentración plasmática de CT, TG, c-LDL y c-HDL. Como se puede apreciar, luego de 8 días de tratamiento con la emulsión parenteral los niveles de lípidos se incrementaron significativamente (p<0,05) con respecto al grupo no tratado.

En la Tabla 2 se representan los resultados de los diferentes biomarcadores de daño a lípidos. Luego de la administración de Lipofundin 20% se produjo un daño marcado sobre estas biomoléculas, lo cual se refleja en un incremento significativo (p<0,05) de las concentraciones de MDA, 4-HA y de ROOH en el grupo tratado respecto al grupo control. Igualmente, en los animales donde se administró el Lipofundin el PP se elevó significativamente (p<0,05) en comparación con el grupo control.

 Tabla 1. Efectos del Lipofundin 20% sobre el perfil lipídico

 

Marcador 

Control

(N=5)

Lipofundin

(N=5)

CT, mmol/L

0,98 ± 0,09

2,21 ± 0,19*

TG, mmol/L

1,41 ± 0,11

2,93 ± 0,06*

c-HDL, mmol/L

0,66 ± 0,08

1,25 ± 0,12*

c-LDL, mmol/L

0,21 ± 0,09

0,94 ± 0,07*

 

 

 

 

Los valores representan la media ± DE. Los asteriscos representan diferencias significativas entre grupos (p<0,05).

 

Tabla 2. Efectos del Lipofundin sobre los marcadores de peroxidación lipídica.

Marcadores de POL

Control

(N=5)

Lipofundin (N=5)

MDA, µM

2,32 ± 0,10

6,39 ± 0,48*

ROOH, µM

16,59 ± 1,29

46,28 ± 2,49*

4-HA, µM

1,68 ± 0,23

5,18 ± 0,31*

PP, µM de MDA

9,12 ± 0,73

17,58 ± 3,33*

 

 

 

 

 Los valores representan la media ± DE. Los asteriscos representan diferencias significativas entre grupos (p<0,05).

 

Discusión

En el presente estudio se pudo observar que a los 8 días de administración de Lipofundin 20%, los valores séricos de CT, TG, LDL y HDL aumentaron en los animales donde se administró esta emulsión lipídica. Este hecho está en concordancia con lo reportado en la literatura (3) y puede deberse al alto contenido de TG presentes en la formulación del producto utilizado para inducir las lesiones ateroscleróticas. Aunque el Lipofundin 20% no posee colesterol en su formulación, el incremento de éste podría estar relacionado con el hecho de que elevados niveles de TG administrados de forma exógena, pueden inducir la síntesis de lipoproteínas en el hígado. Es conocido que en este órgano, los altos niveles de TG pueden inducir la síntesis de ApoB100 y con ello de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), hecho que fue observado en un estudio en humanos donde se comprobó que el Lipofundin al 10% provocaba un incremento de CT en un 60% (9). Las partículas de VLDL que se sintetizan pueden contener TG provenientes del hígado y también de este tipo de emulsiones utilizadas en la alimentación parenteral.

Por otra parte, se ha podido constatar que entre las emulsiones artificiales que se administran y las lipoproteínas plasmáticas se producen intercambios de fosfolípidos y apolipoproteínas (9). Lo antes descrito puede dar explicación al incremento de CT, TG y LDL en las ratas donde se administró el Lipofundin 20%.

El incremento en los niveles de HDL en el presente estudio podría estar relacionado con hallazgos que demostraron que tras la administración de Lipofundin al 10% en humanos se produce una elevación en los niveles plasmáticos de HDL, así como una regresión hacia los niveles basales, una vez que la sustancia es eliminada del organismo. Estas observaciones sugieren que las HDL participan en el catabolismo del Lipofundin (9), lo cual puede explicar el incremento de estas partículas en los animales donde se administró la emulsión lipídica.

El fenómeno de POL afecta la integridad, fluidez y permeabilidad de las membranas celulares, que son esenciales en varias funciones biológicas necesarias para la vida. Sin embargo, desde el punto de vista fisiopatológico la POL puede ser responsable de la oxidación de las LDL y con ello convertirlas en formas aterogénicas y proinflamatorias, así como conllevar a la producción de una serie de derivados con efectos citotóxicos, mutagénicos y carcinogénicos (10).

Para el estudio de los efectos de la POL en los organismos vivos se han caracterizado y estudiado una serie de biomarcadores, entre los que se destacan los derivados estables de este proceso de daño a lípidos. Los aldehídos que se forman durante la etapa de terminación de la reacción radicalaria han sido ampliamente empleados con tales fines (11).

El MDA es uno de los productos terminales de la POL y el más estudiado. Este aldehído es una molécula tóxica que interactúa con el ADN, las proteínas y los aductos que forma con estas biomoléculas son responsables de su marcado efecto mutagénico. Comparado con los RL éste es un metabolito relativamente estable que, en la célula, es capaz de difundir a sitios distantes donde se generó, para atacar otras dianas (2). En el presente estudio se pudo constatar que el Lipofundin indujo un incremento de este biomarcador, lo cual está en correspondencia con otros resultados de nuestro grupo (6). En conejos a los que se administró el Lipofundin 20% se pudo constatar un incremento de este aldehído.

Coherentemente con este resultado, en los animales tratados, se observó una incrementada susceptibilidad a la POL medida a través del PP. Este hecho puede ser una consecuencia de los fenómenos oxidativos que tienen lugar en estados de hiperlipidemia (12). Al incrementarse la susceptibilidad a la POL, se puede inferir que existe una depleción marcada de los mecanismos antioxidantes que protegen a los componentes lipídicos, como es el caso del sistema vitamina E-vitamina C, el ubiquinol, entre otros antioxidantes de fase liposoluble. 

Por su parte, los ROOH constituyen los primeros metabolitos que se forman durante la POL (2). Este marcador de daño a lípidos suele estar incrementado en situaciones patológicas como en la hiperlipidemia, la Diabetes Mellitus y la aterosclerosis (12), lo cual fue constatado en las ratas que fueron tratadas con el Lipofundin.

En futuras investigaciones encaminadas a dilucidar los mecanismos inductores de POL del Lipofundin deberán ser evaluados otros marcadores como los F2-isoprostanos, metabolitos estables y que pueden ser detectados hasta en orina (13), para lo cual deberán emplearse técnicas más robustas.

 

Conclusiones

Los resultados de la presente investigación demuestran por primera vez que el Lipofundin 20% induce procesos de POL en ratas Sprague Dawley, condicionado por un estado de estrés oxidativo, asociado al incremento de los niveles séricos de lípidos (estado de hiperlipidemia) en los animales tratados.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen al personal técnico del bioterio del Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas de la Universidad de La Habana, así como el apoyo del Centro de Inmunología Molecular.

 

Referencias bibliográficas

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4.       Jellinek H, Harsing J, Fuzcesi S. A new model for arteriosclerosis, 1982. An electron microscopy study of the lesions induced by i.v. administered fat. Atherosclerosis 43:7-18.

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13.   León OS, Martínez G, Candelario EJ, García I, Bilbao T, Ledesma L. Balance antioxidante-pro-oxidante: salud y enfermedad, Editorial Ciencias Médicas, Cuba, 2005, 60-5, 84.

 


ISSN 1666-7948
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Revista QuímicaViva
Número 3, año 10, Diciembre de 2011
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