Actividad antiplasmodial in vitro de Calophyllum inophyllum

Ana M. Mesa-Vanegas, Adriana L. Pabon, Silvia Blair-Trujillo.

Grupo Malaria. Sede de Investigación Universitaria (SIU). Universidad de Antioquia.

* Autor para Correspondencia: Ana María Mesa Vanegas

Grupo Malaria. Sede de Investigación Universitaria (SIU). Universidad de Antioquia. A.A 1226. Calle 62 Nº 52-59, Laboratorio 610-611. Medellín, Colombia.

Tel: (574) 219-64-86 - Fax: (574)219-64-87

anammv@gmail.com

Recibido el 13/05/2011 - Aceptado el 17/05/2011

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Resumen

Introducción: Debido a la falla terapéutica y a la resistencia de Plasmodium falciparum a varios antimaláricos existe la necesidad de buscar nuevos candidatos antimaláricos. Dado sus promisorios resultados químicos y biológicos, el género Calophyllum (Guttiferae, Clusiaceae) es de interés en el área de desarrollo de nuevos fármacos por ello, la especie Calophyllum inophyllum puede ser una alternativa para el control de la morbi-mortalidad por malaria. En este trabajo se evaluó la actividad antiplasmodial in vitro de extractos y del acido ursólico obtenidos a partir de hojas de Calophyllum inophyllum. Métodos: El material vegetal seco y molido de C. inophyllum se extrajo por percolación con solventes de diferente polaridad. A partir de los extractos se aisló mediante procesos cromatograficos, un metabolito mayoritario que fue caracterizado mediante técnicas espectroscópicas de RMN. La actividad antiplasmodial in vitro de las muestras se evaluó en la cepa resistente FCB2 de P. falciparum mediante la incorporación de hipoxantina radiomarcada y la detección de la proteína HRP-2. Resultados: Se obtuvieron cuatro extractos de diferente polaridad, se aisló y caracterizó el triterpeno acido ursólico. Se encontró que los extractos y el ácido ursólico presentan actividad antiplasmodial por ambos métodos, algunos con IC50 de 6,33 µg/mL y 13,34 µg/mL para el extracto de metanol (ExtM) y IC50 de 24,48 µg/mL y 46,28 µg/mL para el acido ursólico, con los métodos radioisotópico y HRP-2 respectivamente. Conclusiones: Se validó la actividad antiplasmodial del acido ursólico y del extracto metanólico mediante dos metodologías, sugiriendo la presencia de metabolitos activos contra el parásito, lo que estimula realizar un análisis biodirigido aislando y caracterizando más metabolitos presentes en la planta C. inophyllum.

Palabras clave: P. falciparum - Clusiaceae - Calophyllum - triterpeno - actividad antiplasmodial

Summary

Introduction: Currently, it is necessary to research and development new antimalarial drugs , due to treatment failure and resistance of P. falciparum to various antimalarial drugs. The genus Calophyllum (Guttiferae, Clusiaceae) is of interest because its promising results of chemical and biological activity, so Calophyllum inophyllum could be an alternative for the malaria morbidity and mortality control. This study evaluated antiplasmodial activity in vitro extracts and ursolic acid obtained from the leaves of Calophyllum inophyllum. Methods: The dried and pulverized vegetal material was extracted by percolation with different polarity solvents until exhaustion. From the extracts was isolated by chromatographic processes a major metabolite, which was characterized by NMR spectroscopic techniques. In vitro antiplasmodial activity of the samples was evaluated on continuous culture of P. falciparum strain FCB2, by HRP-2 and radioisotopic methods. Results: In this paper we obtained four extracts of different polarity, moreover was isolated and characterized a triterpene (C30H48O3 ), known as ursolic acid. We found that the extracts and ursolic acid have antiplasmodial activity by two methods evaluated, shown interesting IC50 values: 6,33 µg/mL and 13,34 µg/mL for the methanol extract (ExtM) and 46,28 µg/mL and 24,48 µg/mL for ursolic acid, by HRP-2 and radioisotopic methods, respectively. Conclusions: We report interesting antiplasmodial activity whit ursolic acid and methanol extract by both methods, suggesting the presence of active metabolites against P. falciparum, which encourages to carry out a bioguide analysis for isolating and characterization of other metabolites.

Keywords: P. falciparum - Clusiaceae - Calophyllum - triterpenes - antiplasmodial activity.

Introducción

La malaria es causada por parásitos protozoos, del género Plasmodium, que son transmitidos por la hembra del mosquito del género Anopheles1. Desde 1960 se ha informado la aparición y dispersión de la resistencia a los antimaláricos presentado por P. falciparum en países de Asia, África y Latinoamérica, lo cual se ha relacionado, principalmente a cambios biológicos en el parásito contribuyendo a la persistencia y letalidad de esta enfermedad, aumentado su prevalencia en los últimos 15 años y disminuyendo la efectividad de los medicamentos en muchos países donde la enfermedad es endémica2. Todos estos elementos hacen que hoy la malaria sea un problema de Salud Pública a nivel mundial3. En el año 2007 se registraron 247 millones de casos de malaria en el mundo y aproximadamente un millón de muertes, en su mayoría niños menores de cinco años4.

Una de las alternativas para el control de las complicaciones y muertes por malaria es la adquisición de quimioterapia efectiva, la cual ha sido posible en gran medida, gracias al descubrimiento de compuestos a partir de las plantas como la quinina, la cual fue obtenida de la planta del género Cinchona, siendo el único antimalárico utilizado durante varios siglos y ha sido modelo para sintetizar nuevos análogos antimaláricos como la cloroquina, mefloquina y amodiaquina5. Igualmente, de la planta Artemisia annua (Asteraceae), una hierba china conocida popularmente en este país como Qing hao y empleada por la medicina tradicional por más de 1000 años, se aisló la artemisinina, a partir de la cual se han preparado derivados hemisintéticos como la dihidroartemisinina, artemeter, arteeter y artesunato de sodio6; demostrando que los productos naturales juegan un papel significativo en el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos. Por otra parte, la agencia reguladora en fármacos y alimentos de Estados Unidos (FDA) estima o reporta que aproximadamente el 75% de los fármacos para el tratamiento de enfermedades infecciosas tienen origen natural7.

En la familia Clusiaceae se han aislado compuestos con actividad antiplasmodial, como xantonas y derivados del acilfloroglucinol como por ejemplo en plantas de los géneros Hypericum, Vismia y Garcinia8. En la misma familia se encuentra el género Calophyllum formado por 200 especies y en algunas de ellas se ha reportado la presencia de compuestos de tipo cumarinas, xantonas y triterpenos con actividades antiplasmodial, analgésica, antiviral, antiulcerogénica, anticáncerigena y antibacteriana9. Por ello, es importante realizar estudios para explorar el potencial uso de las especies de Calophyllum hacia la búsqueda de nuevas sustancias que presenten una elevada actividad antiplasmodial. En el tamizaje de las sustancias con actividad antiplasmodial, la utilización inicial de pruebas in vivo presentan restricciones de tipo ético en el uso de animales y elevado costo, y por ello la mayoría de los ensayos iniciales se realizan en cultivos de parásitos in vitro; metodología que permite obtener información confiable con pequeñas cantidades de material biológico, actividad específica sobre el parásito y la posibilidad de evaluar un gran número de muestras10. Dentro de las técnicas más empleadas para determinar la actividad antiplasmodial in vitro se encuentran el método visual, el micro método radioisotópico11, los métodos bioquímicos como las pruebas de la lactato deshidrogenasa parasitaria (LDH) y de la proteína rica en Histida II (HRP-2)12-13, el método fluorométrico y otros métodos particulares que postulan modos de acción como la inhibición de polimerización del grupo Hemo14. Todos estos métodos determinan la inhibición del crecimiento de los parásitos mediante una medición directa o indirecta cuando éste es sometido a diferentes concentraciones de una muestra problema.

Con base en los hallazgos presentes en el género Calophyllum y la necesidad de validar la actividad antiplasmodial, nosotros aislamos y caracterizamos el acido ursólico a partir de extractos de la planta C. inophyllum, evaluamos la actividad antiplasmodial de este compuesto y de cuatro extractos empleando los métodos radioisotópico y HRP-2.

Materiales y métodos

Preparación de extractos y aislamiento del compuesto: Las hojas de C. inophyllum se colectaron en el municipio San Alberto, situado en el departamento del Cesar (Colombia), a 200 m.s.n.m 15. Un espécimen de esta planta se encuentra depositado en el Jardín Botánico Joaquín Antonio Uribe de Medellín con Voucher número 7310A. El material vegetal fue secado a temperatura ambiente, posteriormente 1,103 Kg se molieron y se depositaron en un percolador con Hexano (ExtH, 17,64g), diclorometano (ExtD, 30,67g), acetato de etilo (ExtAE, 14,98g) y metanol (ExtM, 82,45g), previamente destilados. Los extractos obtenidos fueron concentrados a presión reducida en un rotaevaporador, se monitorearon por cromatografía de capa delgada con fase estacionaria de Sílica-gel 60 GF254 Merck® empleando diferentes sistemas de elusión y revelando con lámpara ultravioleta UVGL-58 a 254 y 366 nm y revelador universal. El extracto de diclorometano se sometió a cromatografía en columna flash con fase estacionaria de Sílica-gel 60 GF254 Merck® empleando gradientes de concentración hexano: acetato de etilo y acetato de etilo: metanol y realizando un monitoreo continuo mediante cromatografía de capa delgada. Posteriormente, se realizó cromatografía en capa preparativa con fase estacionaria de Sílica-gel 60 GF254 Merck® para purificar un compuesto mayoritario presente en este extracto denominado CLEDJS9 (135 mg).

Análisis espectroscópico: Los espectros infrarrojo (IR) se obtuvieron en un equipo Perkin-Elmer RX/FT-IR system. Para el análisis espectroscópico de resonancia magnética nuclear se utilizó un espectrómetro Bruker (300 y 250 MHz para 1H), 75 MHz para 13C utilizando cloroformo deuterado (CDCl3) como solvente. Los desplazamientos químicos (d) están expresados en partes por millón (ppm) tomando como referencia el TMS y las constantes de acoplamiento (J) en Herzios (Hz). Además se realizó espectrometría de masas electrospray con tiempo de vuelo (TOF ESI-MS) en un equipo Nermag-Sidar R-10-10C.

Ensayos de actividad antiplasmodial

Plasmodium falciparum: Los ensayos de actividad antiplasmodial in vitro se realizaron con la cepa cloroquino-resistente FCB-2 de Plasmodium falciparum la cual es mantenida en cultivo continuo con la metodología de Trager & Jensen (1976) modificada en eritrocitos A+. Los cultivos son mantenidos a 37°C en una atmósfera de mezcla de gases de 5% de O2, 6% de CO2 y N2 balanceado .16

Evaluación de la actividad antiplasmodial

Método radioisotópico: Para evaluación de la actividad antiplasmodial in vitro de los extractos y del compuesto aislado de la planta C. inophyllum, se siguió la metodología descrita por Bravo J et al., 1999, Desjardins R et al., 1979 con algunas modificaciones. Este método realiza una medición indirecta de la actividad metabólica del parásito, por medio de la incorporación de un precursor de ácidos nucleícos marcado radiactivamente, así: de cada extracto y del compuesto se preparó una solución madre de 10 mg/mL, tomando 2 mg de cada uno y 200 µL de DMSO. A partir de esta se tomaron 50 µL y se ajustaron hasta 1000 µL con RPMI completo sin hipoxantina obteniendo una concentración final de 0,5 mg/mL.

Los ensayos de actividad se realizaron en placas de 96 pozos de fondo plano marca Falcon®, se evaluaron siete concentraciones de cada compuesto en un rango entre 100 µg/mL a 1,56µg/mL, cada concentración se evaluó por triplicado y se prepararon a partir de diluciones seriadas de la solución madre de 0,5mg/mL. La concentración de DMSO en la primera dilución fue de 1% que se ha demostrado no ser tóxica para el parásito, en las siguientes diluciones la concentración de DMSO fue menor. Como control de tratamiento se utilizó la cloroquina, que fue evaluada también sobre siete diluciones seriadas en un rango entre 1,94 µg/mL y 0,03 µg/mL (3,75µM y 0,06?µM). Como control de crecimiento se empleó medio de cultivo. Se preparó una suspensión de glóbulos rojos parasitados con un hematocrito del 2% y una parasitemia del 1%. La concentración final de la hipoxantina tritiada por pozo fue de 0,8 µCi/ml. El cultivo con los tratamientos se incubó a 37 °C durante 48 horas en atmósfera de 5% CO2, 5% O2 y nitrógeno. El plato se congeló a - 20 °C para provocar la hemólisis de los eritrocitos y al día siguiente se descongeló. Los ácidos nucleícos fueron depositados en un filtro de fibra de vidrio con ayuda de un colector semi-automático y fueron leídos en un contador beta. La lectura se expresó en cpm.

Método HRP-2: se emplearon microplacas de 96 pozos de fondo plano marca Falcon®. Se evaluaron 7 concentraciones dobles seriadas, por duplicado tanto de extractos y el compuesto. Se prepara una solución madre de 2mg/mL en DMSO al 1% y posteriormente se preparan las diluciones dobles seriadas en un rango de 200 µg/mL -3,13 µg/mL. Se preparó una suspensión de eritrocitos parasitados con una parasitemia al 0,05% sincronizado en anillos y hematocrito del 1,5%, luego se procedió a distribuir 200µL de la suspensión de eritrocitos parasitados en cada pozo y posteriormente se adicionaron 25µL de las concentraciones crecientes de las muestras y como controles de tratamiento 25 µL de agua desionizada esteril. Se incubaron a 37 °C durante 72 h, se realizó un extendido para verificar crecimiento de los parásitos (por microscopía) a las 24h y 72h. Se sometieron los platos a congelación y descongelación por calor a 37ºC dos veces para causar hemólisis y luego se almacenaron las cajas a -20°C. Teniendo en cuenta la parasitemia obtenida en los pozos control pasadas las 72h se procedió a diluir con agua destilada los pozos hemolizados para dar una parasitemia de 0.02% en el control. ELISA HRP2: Se cubrieron microplatos de ELISA de 96 pozos con fondo en U y de alta fijación (Greiner Bio-One) con el anticuerpo primario (1 µg/mL), se guardaron en bolsa plástica de sello hermético a 4 ºC durante 12 h. Se procedió a transferir 100 µL/pozo de la muestra del plato de cultivo a los platos de ELISA, que fueron incubados por 1h a temperatura ambiente en cámara húmeda. Posteriormente se diluyo el anticuerpo secundario (MPFG-55P,ICL) a 0,05 µg/mL en una solución de PBS al 2% de BSA y 1% de tween-20, se transfirieron 100 µL a cada pozo, se incubó durante 1h en cámara húmeda y luego se lavó nuevamente por triplicado. Se adicionaron 100 µL /pozo de cromógeno 3,3’,5,5-Tetrametilbenzidina (TMB single solution Chromogen/Substrate;Zymed Laboratorios,Inc) durante 10 minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente. Posteriormente se adicionaron 50 µL/pozo de solución de parada (acido sulfúrico 1M) y se determinó la absorbancia a 450 nm en lector de microplatos Bio-Rad 680. Cuando los parásitos de los pozos sin tratamiento crecieron adecuadamente (control), la absorbancia estuvo entre 0,5-2,0 13.

Las concentraciones inhibitoria 50 (IC50 ± IC 95%) fueron calculados para cada compuesto a partir de un modelo de regresión logística no lineal. Se asumió una curva sigmoidea dosis-respuesta con pendiente de Hill (pendiente variable) usando el programa GraphPad Prism 4 for Macintosh versión 4.0b .Los datos fueron analizados y graficados usando GraphPad Prism 4 for Macintosh versión 4.0b (GraphPad Software, San Diego, California, USA).

Resultados y discusión

Caracterización del compuesto acido ursólico: Del extracto de diclorometano se aisló un sólido, blanco, amorfo, con un punto de fusión de 265° C y fórmula molecular C30H48O3, identificado como acido ursólico (Figura 1).

fig1

Figura 1: Estructura del acido ursólico.

Datos espectroscópicos: TOF ESI-MS [ M + Na+ ] a m/z 483,2, m/z 479,3, m/z 451,2 (28), m/z 413,2 (38), m/z 393,2 (21), m/z 301,1 (92), m/z 243,2 (58). IR (cm-1) 3440; 2928; 2871; 1691; 1457; 1387; 1253; 1091. 1H RMN ? (ppm): 1,61 (m, J= Hz, 1H, H-1); 1,49 (m, J= Hz, 1H, H-2); 3,09 (t, J= 8Hz, 1H, H-3); 0,63 (d, J= 11,3Hz, 1H, H-5); 1,41 (m, H-6); 1,38 (m, H-7); 1,40 (m, H-9); 1,81 (m, H-11); 5,14 (t, J= 3,3Hz, 1H, H-12); 0,93 (m, H-15); 1,56 (m, H-16); 2,09 (d, J= 11,5Hz, 1H H-18); 1,35 (m, H-21); 0,90 (m, H-22); 0,88 (s, 3H, H-23); 0,67 (s, 3H, H-24); 0,82 (s, 3H, H-25); 0,71 (s, 3H, H-26); 0,99 (s, 3H, H-27); 0,76 (d, J= 6,5 Hz, 3H, H-29); 0,85 (d, J= 6,2 Hz, 3H, H-30). 13C RMN ? (ppm) (DEPT 135): 36,7 (C1); 26,7 (C2); 78,7 (C3); 38,5 (C4); 55,1 (C5); 18,1 (C6); 32,9 (C7); 39,3 (C8); 47,4 (C9); 36.8 (C10); 23,1 (C11); 125,3 (C12); 138,0 (C13); 41,9 (C14); 27,9 (C15); 24,1 (C16); 47,5 (C17); 52,7 (C18); 38.7 (C19); 38.9 (C20); 30.5 (C21); 20,9 (C22); 27,8 (C23); 15,4 (C24); 15,2 (C25); 16,7 (C26); 23,3 (C27); 180,4 (C28); 20,9 (C29); 16,8 (C30).

Actividad antiplasmodial de extractos y del ácido ursólico: Realizando las curvas dosis-respuesta y ajustando el comportamiento de los datos a una ecuación polinomial y resolviendo dicha ecuación, se calcularon las IC50, los intervalos de confianza y los coeficientes de correlación para ambos métodos (radiosotópico y método HRP-2) (Tabla 1). Se realizaron además curvas sigmoideas dosis-respuesta con pendiente variable (Véase Grafico 1 y Grafico 2). La CQ presentó una adecuada relación dosis-respuesta y una IC50 de 0,188 µg/mL (0,36µM) por el método HRP-2 y para el radioisotopico de IC50 = 0,089 µg/mL (0,17µM).

Tabla 1. Actividad antiplasmodial de extractos y del acido ursólico en la cepa FCB-2 de P. falciparum utilizando dos métodos.

Inhibición de crecimiento de P. falciparum

Cepa FCB-2

Muestra

Método Radioisotopico

Método HRP2

IC50     (µg/mL)

Intervalos de Confianza 95%

IC50     (µg/mL)

Intervalos de Confianza 95%

 

ExtH

23,85

18.62 - 30.54

0,98

ND

ND

ND

 

ExtD

26,89

24.35 - 29.69

0,99

15,82

13.87 - 18.06

0,99

 

ExtAE

42,5

37.48 - 48.19

0,99

42,99

39.63 - 46.64

0,99

 

ExtM

6,33

5.871 .6.820

0,99

13,34

11.12 - 16.01

0,98

Acido Ursólico

24,48

20.57 - 29.13

0,99

46,28

28.94 - 74.00

0,94

 

CQ

0,089 (0,17*)

 

 

0,188 (0,36*)

 

 

CQ= Cloroquina *Unidades micromolar µM
ND = No determinado

 

fig1

Gráfico 2: Curva sigmoidea dosis-respuesta con pendiente de Hill (pendiente variable), Log Concentración Vs % Inhibición médiate el método HRP-2.

La actividad antiplasmodial de los extractos será clasificada según Jonville M, et al (2008)21 con modificación hechas por nosotros. En este trabajo se obtuvieron coeficientes de correlación (R2) estadísticamente significativos para todas las muestras evaluadas encontrándose una relación lineal entre las dos variables cuantitativas analizadas para los cuatro extractos de diferente polaridad y para el acido ursólico. El extracto metanolico presentó una promisoria actividad con IC50 entre 6-15 µg/mL (IC50= 6,33 µg/mL 13,34 µg/mL para el método radiosotópico y HRP-2 respectivamente) lo que sugiere la presencia metabolitos activos. El extracto de diclorometano presentó moderada actividad antiplasmodial (16-30 µg/mL) IC50= 26,89µg/mL en Radioisotopico IC50= 15,82 µg/mL en HRP-2, igualmente para el extracto de Hexano con IC50= 23,85 µg/mL en radioisotopico pese a que no se determinó el valor de IC50 por el método HRP-2. El extracto de acetato de etilo presentó baja actividad antiplasmodial (31-50 µg/mL ). Por otra parte se aisló y caracterizó un compuesto de fórmula molecular C30H48O3 de naturaleza triterpénica pentacíclica con esqueleto tipo ursano caracterizado por la orientación ecuatorial (?) del grupo hidroxilo en posición 3 y un grupo carboxilo en posición 28, conocido como ácido ursólico, para este compuesto la actividad antiplasmodial fue moderada actividad antiplasmodial IC50= 24,84 µg/mL en radiosotopico; IC50= 46,28 µg/mL en HRP-2, encontrándose una correlación con los datos reportados en la literatura, el acido ursólico puede ser empleado como un potencial fármacoforo en el diseño de nuevos candidatos antimaláricos, donde las hojas de C. inophyllum son una fuente de obtencion de este compuesto17-18. Este tipo de triterpenos y sus derivados han sido reportados con actividad anti-HIV19 y han presentado citotoxicidad en líneas celulares tumorales20. Sin embargo, otros compuestos de naturaleza triterpenica pentaciclica de tipo ursano y oleano aislados de Gardenia saxatilis como el acido messagenico A, y acido messagenico B, y una mezcla de acido uncarinico E, ácido 27-O-p-(E)-coumaroiloxioleanolico y acido 27-O-p-(E)-coumaroiloxiursolico presentaron actividad antiplasmodial IC50 = 1,5; 3,8 y 2,9 µg/mL, respectivamente17. Posiblemente la actividad de este tipo de compuestos sea atribuida al grupo hidroxilo en la posición 3 del anillo pentacíclico y por la función ácida del carbono 28 además de su distribución espacial19. Lo anterior nos hace pensar que el ácido ursólico, puede ser empleado como una plantilla estructural para el desarrollo de estudios QSAR (Relación estructura - actividad) con el fin de potenciar su actividad. En lo que respecta a las técnicas empleadas para valorar la actividad antiplasmodial, hay una semejanza con los resultados de IC50 obtenidos por ambos métodos excepto para el extracto de hexano (ExtH), esta diferencia posiblemente se deba a su pobre solubilidad en sistemas acuosos. Por otra parte el método radioisotópico es una técnica costosa y emplea material radioactivo, pero por su gran sensibilidad es la técnica más recomendada para el análisis de una muestra problema y el método HRP2 es simple, presenta un impacto ambiental bajo y puede ser empleado para evaluaciones preliminares de muestras complejas como un extracto. Ambas técnicas son validas para determinar la actividad antiplasmodial de tanto de extractos y compuestos de uso natural como de moléculas obtenidas por síntesis.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero brindado por el ministerio de agricultura de Colombia proyecto (No. 009-2007-V7552-38-07) y a la Universidad de Antioquia. Al profesor Bruno Figadere de la universidad de París por la realización de los espectros. A la Bacterióloga Eliana Arango por la realización de los ensayos de actividad antiplasmodial con la técnica HRP-2.

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ISSN 1666-7948
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Revista QuímicaViva
Número 2, año 10, Agosto 2011
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