Recetas para obtener una señalización específica y una transducción eficiente: Compartimentalización de la señalización


Dr. Martin M. Edreira


INGEBI-UBA-CONICET
Laboratorio de Biología y Genética Molecular de Trypanosomas
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires

Adjunct Research Instructor
Department of Pharmacology and Chemical Biology
School of Medicine - University of Pittsburgh
medreira@yahoo.com

Recibido el 12/07/2011 - Aceptado el 15/07/2011
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Resumen
En oposición al viejo dogma de la libre difusión del AMPc dentro de la célula, hoy en día resultados experimentales avalan la existencia de microdominios de AMPc, mantenidos por barreras físicas y difusión restringida del nucleótido. La compartimentalización de la señal es debida fundamentalmente a la familia de proteínas de anclaje AKAP. Originalmente descriptas como proteínas de anclaje de PKA, las AKAPs tienen la capacidad de orquestar el ensamblado de complejos multiproteicos con otras proteínas involucradas en la vía de señalización del AMPc, como ser ACs, PDEs y Epac. La presencia de las PDE en estos microdominios de señalización es de fundamental importancia debido a que restringen la libre difusión del mensajero y limitan su disponibilidad. De esta manera, la compartimentalización regula la localización, duración y amplitud de la señal, requisitos esenciales para una eficiente transducción del estimulo.

Abstract
In opposition to the old dogma of the free diffusion of cAMP within the cell, today, experimental results support the existence of microdomains of cAMP, maintained by physical barriers and restricted diffusion of the nucleotide. Compartmentalization of the signal is mainly due to the family of anchor proteins AKAP. Originally described as proteins anchoring PKA, the AKAPS have the ability to orchestrate the assembly of multiprotein complexes with other proteins involved in the cAMP signaling pathway, such as ACs, PDEs and Epac. The presence of PDEs in these signaling microdomains is of fundamental importance because they restrict the free diffusion of the messenger and limite its availability. Thus, compartmentalization regulates the location, duration and amplitude of the signal, essential requirements for an efficient transduction of the stimulus.

El AMPc como segundo mensajero
A 50 años de su descubrimiento por Rall y Sutherland [1, 2], el detalle de los mecanismos que gobiernan la transducción de señales mediada por el AMPc (adenosina monofosfato-3',5' cíclico) se encuentra todavía en expansión. El AMPc ha sido implicado como mensajero secundario en una gran variedad de procesos biológicos entre ellos metabolismo, expresión génica, proliferación, diferenciación y apoptosis [3-5]. La unión a receptores de membrana asociados a proteínas G (GPCR) de ligandos tan diversos como hormonas, neurotransmisores y agentes odorantes [6, 7], promueve la activación de proteínas G que estimulan la producción de AMPc por parte de varias isoformas de adenilil ciclasas (AC) [8] (Figuras 1A y B). El aumento de estos niveles intracelulares de AMPc es negativamente regulado a través de su hidrólisis a 5’-AMP por fosfodiesterasas (PDE) [9], una familia de enzimas multigénicas que juegan un importante rol en la transducción de la señal, al limitar la disponibilidad del nucleótido cíclico (Figuras 1A y B).

 


Figura 1. Síntesis y Degradación de AMPc




Efectores del AMPc
La quinasa dependiente de AMPc (PKA) fue identificada a fines de la década del 60 [10] y representó durante mucho tiempo el único blanco conocido para AMPc en células de mamífero [11]. En su estado inactivo, PKA es una holoenzima tetramérica compuesta por dos subunidades regulatorias (R) y dos subunidades catalíticas (C), de las cuales se han logrado identificar varias subunidades R (RI, RIβ, RII, RIIβ) y varias subunidades C (C, Cβ, C). La unión de dos moléculas de AMPc a las subunidades regulatorias resulta en la liberación de las subunidades catalíticas, las cuales poseen varios blancos celulares [4] (figura 2).
En los últimos 15 años se han identificado nuevos efectores del AMPc, como los canales catiónicos dependientes de AMPc (CNG) [12] y la proteína intercambiadora dependiente de AMPc (Epac) [13] (figura 2).
Identificados originalmente en fotoreceptores de retina y neuronas olfatorias, los canales catiónicos dependientes de nucleótido, son canales no selectivos compuestos por heterotetrámeros de dos o tres tipos de subunidades distintas (4 subunidades de tipo A y 3 de tipo B) que poseen sitios de unión a nucleótido [12].
Existen 2 isoformas de Epac, Epac1 y Epac2 [14], ambas poseen dominios de reconocimiento capaces de unir una molécula de AMPc, induciendo cambios conformacionales que llevan a la exposición del sitio catalítico, con el consecuente reconocimiento y activación de GTPasas de la familia de Ras, Rap1 y Rap2 [14, 15] (fig. 2).
Dependiendo del tipo celular, expresión de isoformas y localización, dos de los efectores del AMPC, PKA y Epac, pueden actuar de manera independiente, tener funciones opuestas o converger sinérgicamente en la regulación de una función celular especifica [16].
 


Figura 2. Efectores del AMPc.
 

Compartimentalización de la señal mediada por AMPc
Una gran diversidad de ligandos posee la capacidad de inducir la producción de un solo tipo de mensajero secundario, el cual a través de la activación de un limitado número de efectores logra una precisa regulación de funciones celulares específicas [3-5, 11]. Surge entonces la pregunta: ¿Cuál es el mecanismo a través del cual un único mensajero logra una señal intracelular especifica que produce solo la respuesta celular apropiada?
En oposición al concepto original de la libre difusión del AMPc dentro de la célula [17], que llevaría a la activación no selectiva de efectores, existen pruebas experimentales que indicarían que la difusión del AMPc se encuentra restringida [18, 19]. La compartimentalización espacial de proteínas que producen, son blanco y degradan AMPc, explicaría la gran especificidad y eficiencia de transducción. En esta compartimentalización son de fundamental importancia interacciones proteicas entre efectores y moléculas de anclaje, que serán la base de la formación de microdominios subcelulares que regularán la localización, duración y amplitud de la señal. Las principales proteínas de anclaje que organizan la compartimentalización de complejos multiprotéicos y coordinan una respuesta localizada y específica, son las proteínas de anclaje de quinasa A (AKAP) [20].

Localización de Isoformas de PKA
Identificadas originalmente por co-purificación con la subunidad regulatoria de PKA [21], las AKAPs tienen la capacidad de localizar PKA en distintos compartimientos subcelulares (tabla 1) [20]. Ha sido demostrado que distintas isoformas de PKA (PKA-RI y PKA-RII) presentan funciones biológicas no redundantes, al poseer propiedades bioquímicas y localización subcelular diferencial [21]. En ensayos con cardiomiocitos, empleando la Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia (FRET), fue comprobado que la localización subcelular de las isoformas de PKA se debe su interacción con diferentes isoformas de AKAPs, y que distintos “pooles” de AMPc permiten modular la fosforilación de un subconjunto específico de blancos de PKA [22].

Formación de Microdominios
En la actualidad, la familia de proteínas AKAP cuenta con 43 miembros, los cuales se encuentran invariablemente asociados a membranas o fracciones celulares particuladas (tabla 1). Su caracterización ha permitido establecer que no solo la sublocalización de las isoformas de PKA esta determinada por AKAPs, sino que éstas, además, tienen la capacidad de conformar una plataforma de ensamblaje para otros componentes protéicos involucrados en la señalización mediada por AMPc.
La primera línea de acción en la respuesta mediada por AMPc son los receptores de membrana acoplados a proteína G. En células HEK, se ha demostrado que AKAP5 y AKAP12 interaccionan con el receptor β2-adrenérgico [23], mientras que receptores β1-adrenérgicos, por su parte, interaccionan con AKAP79 y PKA forman un complejo ternario involucrado en el reciclado y resensibilización del receptor [24].
Asimismo, isoformas de la AC han sido identificadas formando parte de complejos con AKAPs, entre ellos AKAP79, mAKAP y Yotiao [25]. En cerebro y corazón de rata, Yotiao interacciona específicamente con las isoformas 1, 2, 3 y 9 de la AC, observándose una regulación negativa de la isoforma 2 [26]. Por su parte, mAKAP recluta a la AC5 [27] que a su vez interacciona a través de su N terminal con proteínas G heteroméricas [28].
Como se mencionara anteriormente, la degradación del AMPc se realiza exclusivamente a través de las PDEs. La localización subcelular de estas enzimas, en proximidad a las ACs encargadas de la síntesis del AMPc, es de vital importancia en la compartimentalización de la señal, ya que las PDE serán las encargadas de restringir la libre difusión del nucleótido. En concordancia con lo observado para las isoformas de PKA, se demostró que isoformas de PDE se localizan en distintos compartimientos y que esta localización diferencial es determinante para la compartimentalización de la señalización mediada por AMPc [29]. En ensayos de FRET se observó que la estimulación de receptores β-adrenérgicos generan múltiples microdominios con elevadas concentraciones de AMPc que activan específicamente un subconjunto de moléculas de PKA ancladas a través AKAPs a túbulos T, y que la difusión del nucleótido fue efectivamente regulada por PDEs [30]. Sumado a esto, ha sido demostrada la participación de PDEs en complejos formados por PKA-AKAP. En cardiomiocitos, PDE4D3 interacciona con mAKAP-PKAII [31]. Por su parte, AKAP450 colocaliza a PKA y PDE4D3 en el centrosoma de células de Sertoli [32]. Y en linfocitos T, donde AMPc esta involucrado en activación, PDE4A interacciona con AKAP149, AKAP95 y MTG; y PDE7A con MTG [33].
Microdominios con un mayor nivel de complejidad se observaron con el ensamblado de complejos multiproteicos como el formado en células HEK por AC8, PDE4, PKA y AKAP [34, 35]. Otro macrocomplejo ensamblado por AKAPs incluyó a mAKAP, PKA, PDE4D3 y a un segundo efector del AMPc, Epac1. En este caso, se observó que la activación de ERK5, que forma parte del complejo por interacción con PDE4D3, puede fosforilar e inhibir a la PDE, llevando a un aumento en la concentración de AMPc (figura 3A). Al mismo tiempo, PDE4D3 recluta a Epac, que a través de Rap1, modula negativamente la activación de ERK5 (figura 3B). Además, se comprobó que la fosforilación dependiente de PKA lleva a la disminución de los niveles locales de AMPc, a través de la activación de PDE4D3 (figura 3C)[36].




Recientemente, los grupo
s de Altschuler [37] y Bos [38], demostraron que Epac1 interacciona a través de su N terminal con miembros de la familia de proteínas ezrin-radixin-moesin (ERM). Al igual que ocurriera con el complejo formado por mAKAP, radixin tiene la capacidad de colocalizar PKA y Epac en un mismo microdominio, y coordinar la activación de ambos efectores del AMPc. Se observó que la deslocalización de Epac de este microdominio resultó en la inhibición de la proliferación mediada por TSH en células de tiroides de rata [37] y la adhesión en células Jurkat [38]. Sumado a esto, fue demostrada la localización de AC activas en los clusters formados por PKA y Epac [37].
La proliferación mediada por TSH de células de tiroides es un modelo clásico de modulación por AMPc. En el mismo, PKA y Epac actúan sinérgicamente para mediar los efectos mitogénicos del AMPc. Ambas vías convergen en la GTPasa Rap1b, a través de la fosforilación mediada por PKA en la serina 179 de Rap1b y el intercambio GDP/GTP inducido por Epac. Activación y fosforilación resultaron ser requisitos excluyentes para obtener una respuesta mitogénica completa [39]. De esta forma, el efecto mitogénico mediado por el AMPc resulta ser un claro ejemplo donde el ensamblado de microdominios conteniendo todos los componentes de esta respuesta, podría explicar la eficiencia y especificidad en la transducción de la señal (figura 4).



Figura 4. Microdominio involucrado en la proliferación de células de tiroides de rata. Radixin, proteína puente entre la membrana plasmática y el citoesqueleto, recluta a los dos efectores del AMPc, PKA y Epac, los cuales colocalizan con AC activas. El aumento de los niveles de AMPc por estimulación local por TSH lleva conduce a la activación (vía Epac) y fosforilación (vía PKA) de Rap1b, eventos estrictamente requeridos para transducir una completa señal proliferativa. Adaptado de Hochbaum, D., et al., Radixin assembles cAMP effectors Epac and PKA into a functional cAMP compartment: role in cAMP-dependent cell proliferation. J Biol Chem, 2011. 286(1): p. 859-66.


Conclusión
El desarrollo de nuevas tecnologías que permiten el estudio de interacciones entre proteínas y su localización subcelular, ha permitido obtener pruebas experimentales como para establecer el concepto de la compartimentalización de la señal como mecanismo de transducción sobre el viejo dogma de la libre difusión del AMPc. Hoy en día, está claro que una señal intracelular especifica y eficiente, que produzca una apropiada respuesta celular estará mediada por microdominios del AMPc que contengan la mayor cantidad de los componentes de la vía.


 

AKAP

Moleculas Asociadas

Localizacion

AKAP-Lbc
Brx
proto-Lbc
Onco-Lbc
AKAP13

PKD
PKCη
Rho

14-3-3
LC3
α-Catulin

Citoesqueleto Actina
Citoplasma

AKAP18 (α, β, γ, δ)
AKAP15
AKAP7

CaV1.1/1.2
PLB
PDE4D

AQP2
NaV1.2a
5’-AMP

Membrana Plasmatica
Citosolico y Nuclear

AKAP79
AKAP150
AKAP75
AKAP5

PKC
GluR1
mGluR1/5
AC5/6
KCNQ2
Kir2.1
TRPV1
IQGAP1

β1-AR
SAP97
PSD-95
PP2B
CaV1.2
ASIC1a/2a
NMDAR

Membrana Plasmatica Densidades Postsinapticas

mAKAP
AKAP100
AKAP6

PDE4D3
Nesprin-1α
Epac
PDK1
Siah2

VHL
RyR
NCX
MEK/ERK5
AC5
HIF-1α

Envoltura Nuclear
Reticulo Sarcoplasmatico

Gravin (α,β,γ)
AKAP250
AKAP12

PKC
β2-AR
CyclinD

 

Membrana miristoilada
Citoesqueleto

D-AKAP1
AKAP84
S-AKAP84
AKAP121
AKAP140
AKAP149
AKAP1

PP1
PTPD1
Lamin B
PDE7A


AMY-1
HIV-1 RT
mRNA
RSK1
PP2Ac

Mitocondria
Reticulo Endoplasmatico

CG-NAP
Yotiao
Hyperion
AKAP350
AKAP450
AKAP120
AKAP9

PP1
NMDAR
KCNQ1
IP3R
PKCε

CK1
PDE4D3
PKN
GCP2/3
CLIC
PP2A

Centrosoma
Golgi
Membrana Plasmatica

Rab32

Varp CD44
ICAM-1/2
RhoGDI

S100P
WWOX

Miofilamentos

Myospryn

Desmin
Dysbindin
Dystrophin

 

Prenilacion N-terminal

Pericentrin

PKC

Tubulin

 Centrosoma

MAP2
A,B,C,D

Tubulin
F-actin
Src

Grb2
Myosin VIIa
Fyn
CaV1.2

Microtubulos

AKAP220
AKAP11

PP1
GSK3β

GABACR
AQP2

Vesiculas

Ezrin
AKAP78
EZR

CFTR
EBP50
NHERF

FAK
Merlin

Citoesqueleto Actina

AKAP95
AKAP8

Condensin
PDE7A
AMY-1p68 RNA

helicase
MCM2

Matris Nuclear



Tabla 1. Nomenclatura y localizacion subcelular de variantes de splicing, isoformas y ortologos de AKAPs, y moleculas asociadas.
Adaptado de Welch, E.J., B.W. Jones, and J.D. Scott, Networking with AKAPs. Molecular Interventions. 10(2): p. 86-97.
 

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ISSN 1666-7948
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Revista QuímicaViva
Número 2, año 10, Agosto 2011
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