BASES MOLECULARES DE LA MEMORIA
¿QUÉ NOS ENSEÑA EL CANGREJO?
Por Mariana Feld, Fernando Locatelli, Ramiro Freudenthal, Emiliano Merlo y Arturo Romano
Laboratorio de Neurobiología de la Memoria
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
La investigación en el área de las bases moleculares del aprendizaje y la memoria ha tenido un enorme impulso en la década pasada y constituye una de las áreas de investigación más activas de la neurobiología de nuestros días. Este estudio se ha enriquecido gracias a la utilización de distintos modelos de memoria y de plasticidad neuronal, desarrollados tanto en vertebrados como en invertebrados, y diversos aspectos de este fenómeno sumamente complejo son abordados gracias a esta diversidad de paradigmas. A su vez, el desarrollo de novedosas metodologías en el ámbito de la biología molecular e inhibidores de distintas vías metabólicas ha permitido ampliar los conocimientos relacionados con los mecanismos moleculares implicados en estos procesos. Un ejemplo de la relevancia del uso de animales “simples” para estos estudios es la babosa marina Aplisia. Grandes avances en este campo se realizaron desde los años de la década del 70 estudiando aprendizajes simples en esta especie que constituyeron la base de los trabajos de Erik Kandel11, de la Universidad de Columbia, EEUU, por los cuales obtuvo el Premio Nobel de Medicina en le año 2000, en reconocimiento a “sus descubrimientos sobre la transducción de señales en el sistema nervioso”. Mucho hemos aprendido de la babosa de mar sobre cómo hace nuestro cerebro para formar memorias. Pero también hemos aprendido de otros animales. ¿Qué nos enseña el cangrejo?
Desde hace ya más de un siglo los crustáceos decápodos han sido utilizados como modelos en distintos paradigmas de aprendizaje y memoria, incluyendo gran diversidad de especies y comportamientos. Algunos cangrejos presentan una gran sensibilidad y agudeza visual. Objetos en movimiento que estimulan la parte superior de su campo visual desencadenan un limitado conjunto de respuestas defensivas estereotipadas, fácilmente discernibles y medibles. Esto presenta una ventaja adaptativa, ya que habitan en general en terrenos llanos (zonas costeras) y son predados por las aves, especialmente las gaviotas. A su vez, muestran una gran capacidad de aprendizaje para adecuar esas respuestas a distintas circunstancias y contextos. Aprovechando estas características, desde el año 1985 hemos desarrollado en el Laboratorio de Neurobiología de la Memoria un modelo de aprendizaje y memoria en estos animales. El protagonista de nuestra historia es Chasmagnathus granulatus (figura 1), un cangrejo semiterrestre que habita en las zonas de transición de agua dulce y salada de las costas del sur de Brasil, Uruguay y Argentina. En el laboratorio se estudió la respuesta de escape del cangrejo a un estímulo visual de peligro, una figura rectangular opaca que pasa por encima de él. Con el fin de cuantificar y analizar dicha respuesta se desarrolló el “actómetro”, un dispositivo experimental totalmente automatizado (figura 2). Cada entrenamiento consiste típicamente en 15 ensayos (E) de presentación de la figura, con un intervalo entre ensayos (IEE) de 3 minutos. Ante la presentación reiterada del estímulo de peligro la respuesta de escape decrece, y es reemplazada por una respuesta críptica que consiste en permanecer contra el fondo del recipiente sin realizar movimiento alguno (“freezing”). Este protocolo de entrenamiento se denomina espaciado, y origina una memoria de largo término, puesta de manifiesto por una robusta retención que perdura por lo menos una semana (Figura 3). En esas condiciones los animales establecen una asociación entre el contexto y la señal de peligro, denominado aprendizaje contexto-señal16. Sin embargo, no se induce memoria contexto-señal (MCS) cuando se utiliza un protocolo de estimulación continua, sin intervalo entre ensayos. Esto es así aún cuando el tiempo total de estimulación sea el mismo que para un entrenamiento espaciado, aumentando así en forma notable el número de ensayos (alrededor de 1 000 E). La MCS es dependiente de la síntesis proteica y de ARN mensajero, dado que drogas que interfieren con los procesos de transcripción y traducción producen amnesia durante el período de consolidación de la memoria19,20 (este concepto será aclarado más adelante). En cambio, cuando se utiliza un entrenamiento masivo (IEE de 4 seg) se induce una memoria intermedia que sólo perdura entre 2 y 3 días, que no depende del contexto (memoria señal, MS), y que es independiente de la síntesis proteica10. La presencia de distintos tipos de memoria generados por los mismos estímulos e incluso de un protocolo de estimulación que no genera memoria de largo término, son herramientas muy valiosas para identificar procesos moleculares implicados específicamente en la formación de la memoria y controlar fenómenos inespecíficos que están siempre presentes en el entrenamiento, tales como estrés, estimulación visual y motora. Es extensivo el estudio de las características de estos tipos de memoria con respecto a la estímulo-especificidad15, contexto-especificidad27, fenómenos de reconsolidación y extinción21, 22 y de neurotransmisores y neuromoduladores involucrados, mediante el uso de agonistas y antagonistas2, 4, 28. Sin embargo, en este artículo nos centraremos en las vías de transducción de señales implicadas en la formación de la memoria.
¿Cuál es la base molecular de la memoria?
Desde fines del siglo XIX, a partir de observaciones en humanos, se desarrolló el concepto de consolidación de la memoria. Según esta teoría, aún hoy en boga a pesar de los múltiples embates recibidos, la memoria primero existe en una forma lábil, pasible de disrrupción, y luego se consolida, pasando a una forma más estable y de larga duración. Distintos agentes pueden disrrumpir la memoria antes de su consolidación, variando desde simples distractores a electro-shock convulsivos o traumas craneanos. Es un fenómeno ubicuo, que ocurre tanto en humanos como en otros vertebrados e invertebrados. El estudio de la consolidación cobró una base bioquímica y molecular a partir del hallazgo de que inhibidores de la traducción y transcripción producen amnesia cuando se administran durante este período crítico. Este fenómeno probó ser prácticamente universal para las memorias de larga duración y muestra una analogía con los períodos críticos del desarrollo. Considerando este aspecto, se definió entonces la consolidación como un período durante el cual nuevas proteínas tienen que ser sintetizadas9. Esto llevó a postular que es necesaria la regulación de la transcripción génica durante la formación de la memoria. Las señales iniciadas por la actividad sináptica deben llegar al núcleo. En este punto debemos aclarar que nuestro enfoque de la memoria no es reduccionista. La memoria se entiende en términos neuronales como modificación de las conexiones sinápticas en los circuitos relacionados con la representación de las experiencias. No hay moléculas de la memoria sino mecanismos moleculares que permiten dichas modificaciones.
En el laboratorio hemos estudiado distintas vías de señalización intracelular involucradas en la consolidación de la memoria y en esta comunicación sinapsis-núcleo. A continuación sintetizaremos las líneas de investigación que hemos desarrollado.
Dos períodos críticos para la consolidación: Proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA)
El papel de la PKA en procesos de plasticidad neuronal relacionados con la memoria fue inicialmente estudiado en los trabajos pioneros del grupo de Kandel, en Aplysia, y posteriormente corroborado en otros modelos de vertebrados e invertebrados. En Chasmagnathus se han obtenido las primera evidencias sobre la facilitación o bloqueo de un proceso amnésico mediante el uso de análogos de cAMP, activadores e inhibidores de PKA23, 24 (Figura 4), en paralelo con resultados obtenidos utilizando otros inhibidores de PKA en pollos29. Este tipo de evidencias farmacológicas, junto con evidencias genéticas utilizando mutantes de aprendizaje y memoria en Drosophila, permitieron poner de manifiesto la relevancia del papel de la PKA en la memoria, que previamente había sido propuesto a partir de modelos in vitro.
¿Cuál es la ventaja de realizar experimentos farmacológicos en Chasmagnathus? La ausencia de una barrera hemato-cerebral endotelial en estos animales permite la administración sistémica de drogas mediante un tratamiento no traumático, trabajando a muy bajas dosis, equivalentes o aún menores a las utilizadas in vitro.
Mediante esta metodología hemos detectado dos períodos críticos de actividad de la PKA durante la consolidación de la memoria, durante los cuales la administración de un inhibidor específico de PKA resulta amnésica. La actividad de PKA se requiere durante el entrenamiento y en un período posterior, entre las 4 y las 8 horas post-entrenamiento13 (Figura 5). Este curso temporal es similar al encontrado para otra quinasa, IKK, que será discutida en la siguiente sección. En coincidencia con estos estudios, PKA está activa en el cerebro de Chasmagnathus inmediatamente después del entrenamiento y a 6 horas después14.
¿Cómo se explica que una vía de señalización que participa en muchos procesos metabólicos tenga un papel tan específico en la memoria, para la que se requiere acción en un limitado juego de sustratos en sitios restringidos? La PKA presenta básicamente dos isoformas, tanto en vertebrados como en invertebrados, PKAI y PKAII, con diferente distribución subcelular, y asociada con distintas proteínas de anclaje. La activación diferencial de estas isoformas conferiría tal especificidad. La participación diferencial de isoformas de PKA en memoria es materia de debate. En este contexto, hemos obtenido evidencias que sugieren un novedoso mecanismo para lograr un aumento prolongado de PKA durante la consolidación, el aumento en los niveles de PKAI, la isoforma más a fin al cAMP (casi 10 veces más afin que PKAII). Esto permitiría activar PKA a niveles muy bajos de cAMP, aún a niveles basales14.
Un novedoso mecanismo de señalización sinapsis-núcleo: Nuclear Factor - kappa B (NF-kB), su inhibidor, IkB, e IkB quinasa (IKK).
Un paso relevante de las investigaciones en Chasmagnathus ha sido el hallazgo de la participación del sistema IKK / NF-kB por primera vez en un proceso de memoria y, a su vez, la obtención de las primera evidencias sobre la activación en las terminales sinápticas, apoyando la hipótesis sobre un novedoso mecanismo de señalización sinápsis-núcleo. Rel/NF-kB es una familia de factores de transcripción muy conservada en la evolución, tanto en sus componentes como en su función. Está involucrada en a respuesta inmune y en apoptosis. Está presente en el sistema nervioso central y existen evidencias sobre su papel en plasticidad neuronal. Distintas señales que llevan a la activación de la proteína quinasa IKK (IkappaB quinasa) lo activan, ya que IKK fosforila al inhibidor de NF-kB, IkB. Esta fosforilación permite la degradación de IkappaB y la consecuente traslocación de NF-kB al núcleo.
En Chasmagnathus, un entrenamiento espaciado, que induce MCS, aumenta la actividad de NF-kB medida a partir de extractos nucleares del cerebro. Por otro lado, hemos determinado dos fases de activación de este factor, de manera similar a la descripta en otros sistemas, donde el mismo es activado. Asimismo, existe una fuerte correlación entre las condiciones de entrenamiento necesarias para la formación de la MCS y aquellas para activar NF-kB, en cuanto a cantidad de ensayos y frecuencia de estimulación 7,8 (Figuras 6a, 6b, 6c). También se ha encontrado activación de NF-kB en extractos sinaptosomales (terminales sinápticas aisladas), inducida por el entrenamiento, constituyendo la primera evidencia in vivo del mecanismo propuesto mediante el cual la transmisión sináptica activa localmente a NF-kB, que luego viaja por transporte retrógrado, a través de las prolongaciónes neuronales, hasta el núcleo. También se ha determinado que un inhibidor de IKK (y por lo tanto de NF-kB) es amnésico y, a su vez, capaz de inhibir la actividad endógena de IKK y de NF-kB en el cerebro central de Chasmagnathus18. El efecto amnésico de la droga tiene lugar de manera coincidente con las dos fases de activación de NF-kappaB previamente observadas (Figura 7), sustentando la idea de que la activación de dicho factor de transcripción es necesaria para la consolidación de la MCS.
Proteína quinasas activadas por mitógenos (MAPKs)
Las MAPKs son proteinas quinasas clásicamente activadas por receptores tirosina quinasas tales como los receptores de factores neurotróficos. En esta familia de quinasas se encuentran, entre otras, ERK1 y ERK2 (por “extracellular signal-regulated kinase” kinasas reguladas por señales extracelulares), p38 (llamada de esta forma debido a su peso molecular) y JNK (kinasa de la región aminoterminal del factor de transcripción c-jun). Las MAPKs son muy estudiadas por su papel en la división celular y apoptosis. Sin embargo, a partir de trabajos realizados en Aplysia y en la potenciación de largo término (LTP) en hipocampo de roedores, se ha observado que ERK1/2 cumplen un papel importante en plasticidad neuronal17,26. Posteriormente se han visto involucradas en procesos de memoria en roedores1,3,26. A pesar de que es una vía muy conservada, no hay todavía trabajos que muestren su participación en procesos amnésicos en modelos de invertebrados.
En Chasmagnathus hemos determinado, mediante anticuerpos, la presencia de una quinasa homóloga de ERK y otras dos quinasas homólogas a JNK1 y 2 en el cerebro. JNK1 y 2 de Chasmagnathus muestran una activación poco específica, ya que se observa también en controles de estrés, estimulación visual y motora. Por el contrario, si bien ERK muestra una activación en los controles, el entrenamiento espaciado provoca una clara activación con una cinética distinta a la de éstos (Figura 8), mostrando una activación significativa a una hora del entrenamiento. A su vez, un inhibidor de esta vía, PD 098059, resulta amnésico únicamente cuando es administrado poco antes del pico de ERK, indicando que esta activación es necesaria para la consolidación de la memoria5. Clásicamente, se atribuye a ERK una función nuclear, fosforilando factores de transcripción, marco en el cual se interpreta su rol en memoria. Sin embargo, en nuestro modelo hemos encontrado únicamente una activación de ERK en la fracción citosólica, mientras que en la fracción nuclear no se observan variaciones. Este resultado indicaría la posibilidad de que ERK posea también sustratos citoplasmáticos, que deben ser fosforilados como parte del mecanismo de consolidación, lo cual presenta una pregunta interesante para el rol de esta vía de transcripción en el sistema nervioso. ¿Cuáles son esos sustratos citoplasmáticos? ¿Qué papel cumplen con la reestructuración de los contactos sinápticos y, en general, en la consolidación de la memoria?
Las vías de señalización intracelular son complejas y, en muchos casos, se encuentran interrelacionadas entre sí. Existe la tendencia a interpretar estudios realizados sobre una proteína quinasa o un único factor de transcripción como los responsables del complejo proceso de la formación de la memoria. Consideramos que este enfoque es incorrecto y que es necesario el estudio de distintos mecanismos moleculares y su inter-relación para llegar a una mejor comprensión del fenómeno. Es en este contexto que estudiamos distintas vías de señalización y su posible interacción. El avance en esta área de investigación se enriquece mediante el uso de distintos modelos, tanto en vertebrados como en invertebrados, que permiten poner en relevancia distintos aspectos de este fenómeno tan complejo.
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