Capítulo I. El blanco y el control

por Celia E.Coto*

Profesora Titular Consulta de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. UBA Investigadora Superior del CONICET.

 

 

El conocimiento de las Ciencias experimentales se construye en base a teorías cuya veracidad requiere de pruebas de experimentación. Pero aunque no tengamos el privilegio de proponer al mundo una teoría nueva, seguramente todos aquellos que se asoman al campo experimental deben saber, en primer lugar, que para otorgarle validez a los hallazgos que realicen deben cumplir obligatoriamente con algunos requisitos. Entre estos requisitos es fundamental incluir en cada experimento, cualquiera sea su naturaleza, un blanco o control, para poder otorgar validez al resultado obtenido.
Aunque en el fondo tienen la misma función el blanco o el control no son siempre equivalentes, en general la denominación de blanco se reserva para las reacciones químicas y el control tiene carácter más universal y debe ser incluído en todo tipo de experimentos.
La presencia de los controles es necesaria no sólo en los experimentos cualitativos sino también en los cuantitativos. Entendemos por cualitativos cuando esperamos una respuesta de todo o nada, hay o no hay, existe o no existe, sin importarnos la cantidad, dicho en otros términos, la respuesta es negativa o positiva. En cambio, en un experimento cuantitativo queremos medir la cantidad de los que estamos buscando en una muestra, por ejemplo: cuántos gramos de algo, cuántos tubos dan positivos, cúantos animales mueren por efecto de una droga, cuántas células hay en un cultivo, cuántas partículas de metal hay en una solución, cuántas bacterias hay en una gota de agua limpia, etc. Los valores cuantitativos se aplican generalmente cuando se quiere comparar entre muestras incógnitas o contra una muestra estándar. Pero este concepto lo estudiaremos en otro capítulo de esta serie.

Con los siguientes ejemplos trataremos de aclarar qué significa un blanco o un control:

Caso 1.

Se desea conocer la presencia de un metal en una muestra de agua (puede ser cobre, hierro cadmio u otro). Se sabe que hay un reactivo (se denomina así a un compuesto químico o mezcla de compuestos químicos que reaccionan con el metal en cuestión) digamos, por ejemplo, produciendo un color. Elijamos el azul. La intensidad del color dependerá de la cantidad de metal presente en la muestra, a mayor cantidad más intensidad tendrá el azul.
Para medir la intensidad del color que nos dará una medida de la cantidad de metal presente en la muestra utilizaremos un aparato llamado colorímetro o uno más perfeccionado como un espectrofotómetro. ¿En qué consiste la lectura?. Colocando nuestro tubo de ensayo en el aparato conseguiremos que una luz atraviese la solución y que sea recibida por un "sensor" que la convertirá en una medida relacionada con la facilidad conque el rayo de luz pueda atravesar la solución. La idea es simple: más oscura la solución pasará menos luz.
Para que la lectura de estos aparatos tenga lugar, primero hay que calibrarlos con una muestra de agua, pero... todo no termina ahí ¿Qué pasa cuando nuestro reactivo es ligeramente coloreado?. La medición final será igual a la suma de:
a) color de reactivo + color de reactivo más metal, con lo que obtendremos una medición falsa, porque nuestra incógnita se comparó contra agua que es transparente.
Lo correcto es preparar un blanco o control que contenga todos los ingredientes de la reacción menos el metal. Este blanco medido contra el agua nos dará un cierto valor positivo que tendremos en cuenta en el cálculo final.
El resultado correcto será:
b) color de la muestra - color del blanco (control) = lectura incógnita. Ahora sí, este valor expresa la verdadera cantidad de metal presente en la muesta.
En este caso y en casos similares, el uso del control evita obtener mediciones erróneas por exceso, al no tener en cuenta el aporte que hacen al sistema, los reactivos.

Caso 2.
Nos proponemos encontrar una droga que impida el crecimiento celular con la esperanza de descubrir un compuesto farmacológico que eventualmente pudiera usarse contra el cáncer. Antes de realizar una prueba en animales debemos probar la droga en un sistema celular en el laboratorio.
Es posible mantener células vivas en recipientes de plástico o vidrio, en los que las células se adhieren a la superficie (cultivo en monocapa), o en suspensión, flotando en el medio de cultivo. Estos medios de cultivo son soluciones complejas que contienen sales apropiadas así como nutrientes necesarios para alimentar a las células. En los laboratorios de cultivos celulares se dispone de unas placas de plástico estériles (libres de gérmenes) en donde se pueden depositar (sembrar) un número apropiado de células. Las células cuando son incubadas (mantenidas) en ese medio alimenticio y a 37º C se dividen, creciendo su número en forma logarítmica hasta que se agotan los nutrientes. Existen varios métodos para contar el número de células vivas. Por eso si deseo probar una droga puedo agregarla al medio de cultivo y comparando con un control podré determinar su efectividad o no.
Veamos el siguiente ejemplo:
Se desea probar el efecto de una droga X y de otra Y sobre el crecimiento celular para ello se siembran en un recipiente 3 x105 células y se incuba por tres días con medio nutritivo (Serie C). En forma similar otro recipiente se siembra con igual número de células y se le agrega medio nutritivo conteniendo droga X, se incuba por tres días (serieA). Por último un tercer recipiente se siembra con igual número de células y luego se incuba con medio nutritivo conteniendo la droga Y, también se incuba por tres días (serie B). Pasado ese tiempo se cuenta el número de células de las series A, B y C y se obtienen los siguientes resultados:

Serie	Número de células por recipiente
C (control)	5 x 106
A (droga X)	3 x 103
B (droga Y)	1 x 102

¿Cómo los interpretamos?. Es evidente la importancia fundamental del control, si comparamos el número de células sembradas 3 x105 con las existentes al día tercero después de la siembra concluímos que se han incrementado aproximadamente 1000 veces. La droga X no les permitió dividirse, ya que al día 3 el número de células es idéntico a las sembradas. Podemos concluir que se trata de un citotástico (detuvo el crecimiento celular), pero la droga Y es aún más promisoria poque no sólo es citostática, sino también citotóxica, ya que respecto del valor inicial, el número de células se redujo diez veces. El experimento se puede analizar también de otra forma, pero resulta más que evidente el papel fundamental del control sin el cual no podría arribarse a ninguna conclusión.

Caso 3.
A pesar que por razones de Bioseguridad cada vez más el uso de isótopos radiactivos decrece, a veces es necesario utilizar isótopos radiactivos para poder determinar el papel que juegan algunas moléculas en los procesos metabólicos de las células. Los isótopos radiactivos de mayor uso en experimentos biológicos son el fósforo 32 (32P), carbono 14 (14C), tritio (3H) y azufre 35 (35S). Recordemos que estos átomos son variantes inestables del isótopo más común estable, que para estabilizarse pierden electrones en forma de radiación electromagnética.
Para medir la emisión de las radiaciones (una forma indirecta de conocer la cantidad de sustancia que tengo) se utiliza entre otros aparatos el "espectrofotómetro de centelleo" más conocido en la jerga del laboratorio como centellador. Este aparato permite alojar frascos de diferente tamaño en los que se coloca la muestra radiactiva disuelta en una solución "centelladora". Esta solución no es más que la mezcla de dos solventes orgánicos cuyos átomos al ser bombardeados por los electrones emiten fotones ( partículas o cuantos de luz). Los fotones, a su vez, son convertidos en el espectrofotómetro en impulsos eléctricos que activan un contador luminoso que registra el número de desintegraciones por minuto. La desintegración de los átomos no es un fenómeno contínuo sino que el número de pulsos por minuto resulta del promedio de desintegraciones que se realizan al azar. ¿Y el control, se preguntarán Uds.? Aquí también es necesario un control. Siempre en el medio ambiente se producen radiaciones naturales que son registradas por el aparato y también intervienen otros factores como el tamaño de la muestra, la cantidad de líquido, el tipo de aparato y otras variables más complejas de explicar. El hecho es que nuestra muestra debe ir acompañada de otra muestra blanco que contenga, en un envase similar, el líquido de centelleo sin la muestra.
Para obtener el resultado se debe proceder así: a la lectura de desintegraciones por minuto conocidas como cpm (cuentas por minuto) hay que restarle las cpm del fondo. Valor que no afecta demasiado los resultados si el número de cpm de la muestra que se cuenta es alto, pero igual estará indicando la validez del experimento. Porque no sería raro que, por accidente, se hubiera contaminado el solvente usado con material radiactivo, y si no incluímos el blanco nuestra lectura podría resultar errónea.

Caso 4.
Los experimentos que se realizan con animales son muy frecuentes, aunque hay una tendencia a evitar su uso por razones humanitarias y reemplazarlos por otros sistemas.
Sin embargo, muchas veces son paso indispensable antes de realizar ensayos en el hombre. Hay muchos tipos de experimentos que se pueden realizar con animales, en especial, ratones, que por su pequeño tamaño son más manejables que las ratas. Por otro lado, la experiencia acumulada en la Ciencia a través de tanto años de experimentación indica que los resultados obtenidos en ratones son de inmediata aplicación al hombre. Existen además ratones endocriados (obtenidos por cruzamiento entre ratones familiares) y libres de gérmenes, de modo de evitar que el resultado de un experimento sea complicado por la participación de microrganismos ajenos a la experimentación. Vamos a describir el caso de un experimento en el que se desea conocer el efecto de la infección con un agente patógeno en el ratón. En primer lugar, debemos trabajar con un número relativamente grande de animales, por ejemplo 10, para que los resultados sean significativos. La noción de significación la estudiaremos en otro capítulo, para el ejemplo que daremos no es necesario conocer su importancia.
El protocolo ( así se lo denomina al esquema o diseño del experimento) será el siguiente:
Serie A. 10 ratones (de determinada edad o peso) serán inoculados con una cantidad conocida del agente patógeno y se mantendrán en observación durante 30 días, alimentándolos diariamente y con toda la cantidad de agua necesaria para beber a su disposición (ad libitum). Todos los días serán revisados y se registrará el número de enfermos o muertos. Como dato final se tendrá en cuenta la mortalidad (número total de muertos) y la morbilidad (número total deenfermos).
Serie B. 10 ratones similares serán inoculados con la solución en la que estaba suspendido el agente patógeno pero sin el agente (placebo). Serán observados del mismo modo que la serie A y constituye el grupo de animales controles. En el siguiente cuadro se analizan los resultados de tres experimentos hipotéticos.

Serie	Número de animales enfermos	Morbilidad       %	Número de animales muertos	Mortalidad        %
Experimento 1
A	10	100	10	100
B (control)	2	20	0	0
Experimento 2
A	10	100	10	100
B (control)	9	90	9	90
Experimento 3
A	2	20	0	0
B (control)	0	0	0	0

Analicemos los resultados:
Experimento 1. Es altamente probable que los ratones sean muy susceptibles al agente patógeno. Como los 2 enfermos del control se recuperaron podría ocurrir que estuvieron enfermos porque no eran completamente sanos al inicio del experimento y las condiciones de estrés producido por la observación diaria les produjo síntomas. De todos modos la observación de la enfermedad es muchas veces subjetiva mientras que la muerte es una reacción incuestionable.
Experimento 2. La similitud de comportamiento entre los inoculados con el agente patógeno y el placebo hacen pensar que los animales murieron por causas ajenas al patógeno inoculado.
Experimento 3. Aquí podemos concluir que estos animales no son susceptibles al agente patógeno, valen las observaciones sobre la enfermedad efectuadas antes.

¿Qué habría sido de nuestro experimento número 2 de no haber incluído un grupo control?. Hubiéramos arribado a conclusiones falsas y cuál es la importancia en los otros, aseverar que la interpretación de los resultados es correcta.

 

Conclusión

Hemos presentado aquí varios ejemplos del papel que el blanco o control juega en la interpretación de resultados experimentales, es la forma de validar que un solo componente presente es el desencadenante de una respuesta. Por lo temprano de estas clases no quisiera polemizar sobre algunos factores que a veces entorpecen esta conclusión.