Curso de Introducción al conocimiento científico experimental*

por  Dra. Celia E. Coto

 

 Capítulo 14  

                                                                                          

 

 Herramientas moleculares: Biotecnología

 Parte 2.                                                         

                                                                                                                   

Introducción.

 

            Vimos en el capítulo anterior los conocimientos indispensables para entender algunas de las reacciones biológicas que se utilizan en la actualidad y cuyos nombres trascienden ya al público en general. Sin embargo, los lectores sabrán comprender que pretender resumir en un único capítulo lo  ocurrido con la Biología Molecular en un período mayor de 50 años significa reducir los conocimientos a las explicaciones más elementales. Por ello hemos dado cuenta de los procesos generales sin aclarar los detalles. Hoy en día, se dispone de mucha bibliografía de consulta para completar el tema, tarea que podrán encarar todos aquellos insatisfechos con la información brindada en el capítulo 13. En la sección sitios de la página de Quimicaviva  encontrarán algunos recursos útiles para ello.

 

            En esta segunda parte, continuaremos con una forma sencilla de presentación de las aplicaciones concretas de las técnicas derivadas del conocimiento de la Biología Molecular. Nuestro objetivo es lograr que el lector incorpore información, que se complica muchas veces por el uso abundante de abreviaturas y códigos. Es comprensible que el uso reiterado de una abreviatura en lugar del nombre completo facilite la escritura pero muchas veces la abreviatura puede resultar apta para nombrar más de un término y es entonces cuando en lugar de aclarar, oscurece. A modo de guía de cómo se desarrollará este capítulo, repetimos la figura 1 del capítulo 13 y trataremos de explicar cada una de las derivaciones señaladas en el esquema.

 

Alcances de las técnicas moleculares.

 

Figura 1. Esquema de los alcances del uso de la tecnología del ADN recombinante.

 

Ingeniería genética

            La ingeniería genética se define como la alteración deliberada del genoma de un organismo por medio de la manipulación de su ADN de modo de producir un cambio en sus características hereditarias. Como toda definición, la de ingeniería genética es breve y concisa. Sin embargo, quisiera realizar algunos comentarios. Es cierto que la ingeniería genética es una alteración deliberada del genoma de un organismo, dicho de otro modo, es el cambio de un gen o genes por el/los de otro organismo con técnicas de laboratorio. Pero no siempre la ingeniería genética se aplica con ese objetivo de producir cambios en las características hereditarias. Esta técnica va más allá, de la producción de organismos rediseñados como nuevas especies, permite también otras aplicaciones como la terapia génica, la producción de reactivos y el diseño de equipos para diagnóstico e investigación. 

 

Más herramientas moleculares.

 

            En el capítulo 13 estudiamos las técnicas del ADN recombinante que tienen que ver con el uso de una molécula de ADN como molde e hicimos hincapié en los casos de la transferencia de información del ADN al ARN, nos falta discutir sobre una técnica conocida como transcripción reversa de uso tan común como la descripta antes. La transcripción reversa, se denomina así porque utilizando un molde de ARN es posible sintetizar ADN, usando para ello la enzima transcriptasa reversa.

 Por un período que abarcó desde la publicación de la estructura del ADN hasta la demostración de la existencia de la transcriptasa reversa ocurrida en 1970 el dogma central de la biología molecular era el presentado en la figura 2. El estudio de la replicación y comportamiento de un grupo de virus causantes de leucemia y tumores en animales cuyo genoma o ácido nucleico era ARN llevó a sospechar que replicaban a través de un ADN intermediario.

En el año 1970 H.Temin y D.Baltimore recibieron el premio Nobel por su descubrimiento de la enzima transcriptasa reversa, responsable de transcribir ADN usando una hebra de ARN como molde, aislada a partir de partículas virales. Posteriormente a este espectacular hallazgo este grupo de virus pasó a denominarse retrovirus y a la familia a la que pertenecen  Retroviridae. Hay que lamentar que un virus miembro de esta familia, de reciente aparición, ha matado ya a más de dos millones de personas, se trata del virus HIV (virus de la inmunodeficiencia humana) agente causal del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Nosotros preferimos llamar al virus HIV y no VIH (su forma española), porque los virus tienen una nomenclatura universal en la que la V de virus se pone al final, HIV significa human immunodeficiency virus.

 

 

 

ADN

 

ARN

 

Proteína

 

Figura 2. Muestra el flujo de información del dogma central de la biología molecular, flechas verdes).  La flecha roja muestra que el flujo contrario también existe, es la llamada transcripción reversa.

 

 

Cebadores o primers

            Se conoce con el nombre de cebador o primer a una secuencia polinucleotídica de longitud variable, no inferior a cinco nucleótidos. Cebador y primer son nombres equivalentes, es decir, uno es la traducción del otro. Cebador se refiere a todo dispositivo capaz de iniciar una reacción física o química. El papel de los cebadores para la  duplicación de las cadenas de ADN dentro de la célula es fundamental. Si uno quiere hacer una copia para que se inicie la síntesis de una nueva cadena utilizando como molde una cadena simple es necesario que el extremo de la cadena sea doble. Esto se logra pegando un primer en el extremo 3’, luego, a partir de ese primer la ADN polimerasa continuará copiando la cadena molde hasta duplicarla. Si analizamos con detalle la figura 3 podemos apreciar lo que ocurre. Por supuesto que en el tubo de ensayo tenemos que suplir además una “sopa” de nucleótidos, iones magnesio, la ADN polimerasa, etc.

            Los cebadores se preparan sintetizándolos en forma apropiada de modo que se complementen con la zona del ADN que deseamos copiar. Si en lugar de una hebra de ADN se usa como molde una de ARN necesitamos la presencia de la transcriptasa reversa.

 

 

1. 3’ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ5’

    5’      ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ3’

 

2. 3’ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ5’

 

    

    5’ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ3’

 

3. 3’ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ5’

    5’ÄÄÄÄ

    cebador 1

 

                                                             cebador 2

   5                                                         ÄÄÄÄ3’

   3ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ5’

 

4. ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

    ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

 

    ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

    ÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄÄ

   

  Ä = A      Ä = T        Å = C        Ä = G   

 

Figura 3. Síntesis de nuevas cadenas de ADN utilizando cebadores. En el paso 1 tenemos las dos cadenas unidas formando un dúplex. Por calentamiento podemos separarlas, es lo que muestra el paso 2. Recordemos la orientación de las cadenas 3’5’ para una y  5’3 para su complementaria  (ver figura 4 del capítulo 13). En el paso 3 vemos que un cebador complementario se ha pegado al inicio de cada cadena. Luego se produce la elongación en el sentido 3’5’ (ver que la síntesis siempre ocurre en el sentido 3’5’ independientemente de la orientación de la cadena molde) y la cadena se copia  siguiendo el principio de la complementariedad hasta llegar al extremo. El paso 4 muestra que como resultado de esa síntesis se formaron dos nuevas dobles cadenas idénticas. Se puede observar que cada dúplex está formado por una hebra parental y una hebra recién sintetizada, a esta forma de replicación se la conoce con el nombre de semiconservativa. 

 

Resumen breve de lo aprendido hasta ahora en este capítulo y en el anterior.

 

·                      Los principios de complementariedad entre las bases que forman el ADN para asegurar la síntesis de cadenas idénticas.

·                      La importancia de las uniones hidrógeno que permiten dicha complementariedad.

·                      La existencia de las enzimas de restricción que permiten cortar al ADN en numerosos fragmentos dejando la posibilidad de insertar en la cadena cortada, fragmentos de ADN de otros organismos.

·                      La importancia de los plásmidos en el clonado molecular.

·                      La hibridización molecular entre cadenas ADN/ADN ó ADN/ARN.

·                      La transcripción reversa que permite la síntesis de ADN a partir de ARN.

·                      La necesidad de un cebador o primer para iniciar la síntesis de cadenas nuevas.

·                      Saber que la replicación del ADN es semiconservativa.

 

 

 

Hasta este punto todo lo que aprendimos tuvo que ver con los aspectos teóricos del campo molecular del ADN sin entrar en detalles de cómo esos procesos ocurren dentro de una célula y cómo se llevan a cabo en el laboratorio. Presentaremos a continuación los fundamentos de algunas técnicas en uso, necesarias para realizar experimentos con ADN en el laboratorio.

 

Electroforesis en gel: técnica para separar fragmentos de ADN.

 

                La electroforesis en gel es una técnica ya conocida desde hace mucho tiempo que se usa para separar moléculas en base a sus características físicas tales como tamaño, forma y punto isoeléctrico1. Es útil para separar fragmentos de ADN de distinto tamaño y aplicar en forma analítica (para el análisis directo) o preparativa (conseguir una cierta cantidad), es el caso cuando se purifican moléculas antes de aplicar otros métodos. Específicamente, la electroforesis aplicada al ADN se usa para  purificar moléculas que serán usadas, entre otros objetivos en la reacción de PCR (reacción de polimerasa en cadena), clonado molecular, secuenciación y técnicas de inmunotransferencia.2  La electroforesis en gel ha tenido su mayor aplicación para la separación de proteínas.

       Para realizar una electroforesis se debe elegir un soporte (papel, celulosa, poliacrilamida, agar) sobre el que se siembra la muestra y sumergir el soporte  en una solución dentro de una bandeja. Cuando se separan proteínas o ácidos nucleicos cortos (oligonucleótidos) se usa acrilamida, según la concentración de acrilamida se forman geles de distinta porosidad. Para asegurar el entramado del gel se agrega una sustancia que favorece el entrecruzado formando así el gel conocido como poliacrilamida que se diseña de acuerdo al tipo de moléculas que se desee separar. Recordemos que la poliacrilamida es un neurotóxico y debe ser manipulada con cuidado. Para el caso del ADN el soporte ideal es un gel de agarosa (no tóxica), en especial para moléculas de ADN de gran tamaño. Esta sustancia proviene de un alga marina. La agarosa se vende en polvo y se disuelve en agua destilada por calentamiento, al dejar enfriar la solución en un molde apropiado de forma rectangular o circular (caja de Petri) forma una capa de un material parecido a la gelatina pero más consistente que tiene una matriz conteniendo poros o canales. La electroforesis permite separar las moléculas por tamaño sometiéndolas a la acción de un campo eléctrico. Las moléculas se moverán dentro de la matriz del soporte, a través de los canales del agar. hacia uno de los polos y la velocidad de migración dependerá de su tamaño, cuanto más pequeñas sean se moverán más rápidamente. La figura 4 muestra un aparato de electroforesis horizontal con sus conexiones, mientras que la figura 5 muestra un aparato vertical.

 

 

 

Figura 4. Aparato de electroforesis horizontal, los cables se conectan a una fuente de poder. En las canaletas se coloca la solución buffer y  en el centro del aparato se apoya la muestra sembrada sobre una capa de agar sobre un soporte de vidrio. Mediante un artefacto llamado peine se crean una serie de calles en el agar por las que correrán las muestras de ADN o de proteínas.

 

Figura 5. Aparato de electroforesis vertical.

      

 

Cuando se aplica la corriente eléctrica al gel, la fuerza electromotriz mueve a las moléculas a través de la matriz del gel hacia el ánodo (electrodo positivo) si las moléculas están cargadas negativamente o hacia el cátodo (electrodo negativo) si están cargadas positivamente. Para el caso de los ácidos nucleicos, éstos tienen cargas negativas debido a su esqueleto azúcar-fosfato (ver capítulo 13).

       Las proteínas pueden tener formas complejas y cargas diferentes en consecuencia  puede ser que proteínas del mismo tamaño no migren en el gel a velocidades similares. Por esa razón las proteínas se desnaturalizan en presencia del detergente dodecil- sulfato de sodio más conocido como SDS. Este detergente recubre a las proteínas con una carga neta negativa. Además, la cantidad que se une es proporcional al tamaño de la proteína de modo que este tratamiento les confiere una carga negativa y además todas las proteínas tienen una carga similar relacionada a su masa. Las proteínas desnaturalizadas toman la forma de bastones largos y en consecuencia la velocidad de migración en el gel no depende de la carga y forma sino de su tamaño. En la figura 5 se muestra una corrida electroforética de proteínas.

 

 

     A     1    2     3     4    5   6     7    8   B

Figura 6. Gel de proteínas. Corrida de electroforesis de mezclas de proteínas reveladas con coomassie blue.  Las flechas (A y B)  indican las calles donde se sembró la mezcla de proteínas de referencia. Los números indican las calles de siembra. Si observamos con detenimiento, sin tener referencias exactas de este experimento, vemos que en las calles 1 y 3 se ha sembrado la misma muestra. Lo mismo ocurre si comparamos las calles 2 y 4. En las calles 7 y 8 hay una sola proteína pero no es la misma ya que su posición relativa en el gel es muy distinta. La flecha roja muestra la serie de muescas que se hacen utilizando la ayuda de un peine especial, estas muescas delimitan las calles en donde se siembran las muestras. Las cabezas de flechas verde y negras muestran las bandas correspondientes a las proteínas cuyo peso molecular se conoce. En los bordes de los geles las corridas suelen deformarse, observar el extremo izquierdo y compararlo con el derecho.

 

Tal como describimos antes las calles extremas del gel de la figura 5 contienen una mezcla de proteínas de distinto peso molecular (escalera) y las calles del centro permitieron analizar distintas mezclas de proteínas conteniendo varios constituyentes. El peso molecular de cada banda se puede calcular por referencia a los pesos moleculares patrones.

La figura 7 muestra un gel para ADN.

 

 

Figura 7. La flecha parte desde el lugar de siembra, la presencia de un colorante permite visualizar el lugar de la siembra. A su vez, a medida que transcurre la electroforesis el colorante permite observar el frente de la corrida y de ese modo permite elegir el momento de corte, antes de que salgan del gel. Cada segmento coloreado corresponde a una calle donde se puede correr una muestra en particular

 

       Cuando se desea teñir ADN se puede recurrir al bromuro de etidio, a un colorante fluorescente o la muestra puede contener un nucleótido radiactivo. Así es posible fotografiar la corrida iluminada con rayos ultravioleta. Si la muestra contiene un nucleótido radiactivo, se revela por autorradiografía. Métodos y tinciones hay muchos lo importante aquí es que los lectores adquieran el concepto de cómo se pueden separar las moléculas según su tamaño. Las moléculas de ADN doble son casi bastones por lo que al igual que las proteínas su velocidad depende de su tamaño. En la figura 8 se ve un ejemplo de corrida de ADN, es la misma muestra de ADN cortada con distintas enzimas de restricción (ver capítulo 13). Cada enzima da lugar a un patrón de corte diferente de acuerdo con la secuencia del ADN cortada.

 

Figura 8. Patrón de restricción de una muestra de ADN, en la calle de la izquierda se corrió la muestra patrón que permite determinar los pesos moleculares. En las calles siguientes la misma muestra de ADN fue sometida a la acción de diferentes enzimas de restricción cuyos nombre figuran en la base de la corrida.

 

Momento de recapitular

       Ya aprendimos cómo puede separarse una muestra de ADN sólo falta que la saquemos del gel, para eso cortaremos la banda del agar y la obtendremos en forma pura, pero antes de detenernos en cómo hacerlo vamos a ver las aplicaciones directas. Al tener separado un trozo de ADN correspondiente a un gen viral podríamos, por ejemplo, producir un biofármaco.

 

Ejemplo de aplicación de las técnicas moleculares: Obtención de la vacuna contra el virus de la hepatitis B.

       Los virus además de ser extremadamente pequeños (sólo pueden ser vistos con el microscopio electrónico) están compuestos por una genoma rodeado de proteínas que protegen a este ácido nucleico y además le permiten saltar de célula en célula para poder multiplicar ya que son parásitos obligados. Es decir que sólo pueden reproducirse dentro de una célula ya que ésta contiene  todos los elementos necesarios para sintetizar ácidos nucleicos.

 La figura 9 muestra un corte esquemático de la partícula del virus de la hepatitis B.

 

Figura 9. El diagrama A muestra a la partícula de virus completa conocida con el nombre de partícula de Dane, cuyo tamaño es de 40 nm. 1. Enzima polimerasa, 2. ADN, 3.core (núcleo interno) 4. Membrana. Se destaca en la membrana el antígeno HBsAg denominado así por ser el antígeno o proteína viral de superficie. En la sangre de las personas infectadas circulan también dos tipos de partículas más que no son infecciosas porque carecen de ADN. La partícula B es filamentosa con una longitud de 200nm y la C que es esférica de 20 nm de diámetro. Este dibujo modificado del original se obtuvo de: http://pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-virus.htm

 

       Cuando un virus ingresa a un organismo, el organismo mediante el auxilio del sistema inmune sensa que hay proteínas extrañas circulando por ahí. Entonces como estudiamos en el capítulo 8 de este curso, primero aparecerá una respuesta natural innata y luego de un tiempo una respuesta inmune específica.

¿Qué es lo que ven las células del sistema inmune que las alertan? Ven, reconocen o sensan antígenos (proteínas externas del virus) que para el caso del virus de la hepatitis B vemos que se trata del antígeno de superficie HBsAg como se muestra en la figura 9 A. La pregunta que se hicieron los científicos especializados en diseñar vacunas fue la siguiente. Si insertamos el gen responsable de que se sintetice el antígeno de superficie en una bacteria ¿produciría ésta grandes cantidades de antígeno?. Les adelanto la respuesta, sí lo produce pero como el antígeno debe ser glicosilado (se le adicionan azúcares) para ser efectivo y las bacterias no tienen sistema de glicosilación la proteína que se forma no es inmunogénica. Entonces se les ocurrió insertar el gen del virus de la hepatitis B en una levadura. La tan conocida Saccharomyces cereviseae utilizada en la producción del pan y de la cerveza. La levadura, sí tiene cómo glicosilar a la proteína codificada por el gen S, responsable del antígeno, y lo produce en cantidad. Luego esa proteína es purificada y combinada con ión magnesio para ser administrada como vacuna. La ventaja de esta vacuna es que no contiene virus.

Veamos entonces cómo se procedió a obtener el gen del HBsAg, para ello nos vamos a detener en la figura 10 que muestra una representación del genoma del virus de hepatitis B.

 

Figura 10. Genoma del virus de la hepatitis B    http://wwwmicro.msb.le.ac.uk/3035/HBV.html. Los dos círculos negros indican que se trata de un ADN circular doble cadena aunque una porción dibujada con rayitas es de cadena simple. Por convención, a una de las cadenas se la denomina menos (-) y la otra es más (+). Se muestra el origen de la replicación en el 0 y al lado el número 3221 que se refiere al número total de nucleótidos que tiene el genoma viral. Las flechas de colores muestran el tamaño de los genes y el sentido de su lectura. En azul se señala el gen de la polimerasa viral (P), en verde la proteína de la cápside C (cubierta viral), en amarillo el gen X que no tiene una  función definida y en rojo el gen S correspondiente al antígeno de superficie. Nótese que hay dos regiones pre-S1 y pre-S2 que no son necesarias para la expresión del gen S en un vector.

 

       Es interesante destacar que los genes poseen nucleótidos compartidos ( se superponen) es lo que se conoce con el nombre de genes solapados, si miramos la figura vemos, por ejemplo, que el gen S tiene una región común con el gen P, pero al empezar en otro nucleótido y terminar previamente resulta un polipéptido diferente. Esta situación refleja la exquisita regulación de la información creada por los virus para subsistir, así un genoma tan pequeño como el del virus de la hepatitis B codifica por cinco proteínas.

 

Volviendo a los pasos de la obtención de la vacuna contando ya con  el conocimiento de las técnicas.

1.         Localización del gen S en el genoma viral

2.         Corte con enzima de restricción.

3.         Separación del ADN en un gel de agarosa.

4.         Obtención del ADN.

5.         Recombinación con un plásmido bacteriano  (ver figura 12 del capítulo 13)

6.         Producción de bacterias conteniendo los plásmidos

7.         Recombinación del plásmido bacteriano con uno de levadura para su expresión.

8.         Crecimiento de la levadura recombinante en tanques de fermentación.

9.         Purificación de la proteína HBsAg a partir del líquido del cultivo.

10.     Formulación para la vacuna. Envasamiento y distribución.

11.     Aplicación inyectable. Inmunización-vacunación específica.

 

 

Conclusiones

       He tratado de explicar en la forma más sencilla posible las técnicas moleculares desarrolladas a partir del conocimiento de la estructura del ADN y de las enzimas de restricción así como el principio de otras técnicas de uso común en los laboratorios. Los que deseen aprender en profundidad pueden consultar libros de texto o la información que se brinda en Internet , ésta última de gran valor suele tener, sin embargo, algunos errores. Creo conveniente reservar para un próximo capítulo la explicación de otra técnicas de aplicación general como la inmunotransferencia y  la PCR.

 

1. Punto isoeléctrico: la carga de una molécula de proteína variará según el pH de la solución en que se encuentre. El punto isoeléctrico de una proteína es el pH al cual la carga neta de la molécula es cero.

 

2. Inmunotransferencia esta técnica se explicará en el capítulo 15

 

* Este curso es una contribución de Química Viva educativa  (e-Lab) a la propagación del conocimiento científico entre los estudiantes de la escuela secundaria. Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

 

                                         Volver al menú de selección de capítulo.
 


ISSN 1666-7948
www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar

Revista QuímicaViva
Revista Electrónica del Depto. de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 
quimicaviva@qb.fcen.uba.ar