El heterocomplejo
hsp90•inmunofilina de alto peso molecular como maquinaria molecular de
transporte de proteínas solubles
Dr. Mario D. Galigniana*
Instituto de
Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires-Fundación Instituto Leloir
Av. Patricias Argentinas 435, Buenos Aires (C1405BWE),
Argentina.
Tel. 54-11-5238 7500
(Ext. 3308); Fax 54-11-5238-7501
E-mail: mgali@leloir.org.ar
Recibido: 14/6/05
Aceptado: 28/6/05
RESUMEN
Es sabido que el movimiento de proteínas englobadas en
vesículas utiliza al citoesqueleto como vía de
transporte. Sin embargo, nada se sabe acerca del mecanismo de transporte de
proteínas solubles no asociadas a vesículas. Factores relacionados a cascadas de
señales como MAPKs, STATs,
p53, NFκB, receptores de esteroides,
ciclinas, etc., no están confinados de manera estática a un compartimiento
celular dado como el citoplasma o el núcleo, sino que se encuentran en
equilibrio dinámico entre dichos compartimientos, aún cuando el factor en
cuestión se encuentre mayoritariamente concentrado en uno de ellos. Siempre se
ha asumido que la fuerza que genera el movimiento de proteínas solubles es la
difusión simple. La deslocalización de proteínas produce grandes trastornos en
la célula y es responsable de por lo menos doscientas patologías bien
caracterizadas, entre ellas varios tipos de cáncer. En consecuencia, responder
cómo las proteínas solubles se mueven es aún una asignatura pendiente muy
importante para la Biología Celular, en particular cuando se trata de factores
relacionados con las cascadas de señales. Los receptores de hormonas
corticosteroides constituyen un excelente modelo experimental para el estudio
del tránsito de proteínas solubles ya que la localización subcelular de los
mismos puede ser manipulada por agregado o no de la hormona. Es así que estos
receptores se localizarán mayoritariamente en el citoplama en ausencia de
ligando y serán nucleares en su presencia. El modelo clásico de activación de receptores
esteroidales sostiene que, al unirse la hormona, el complejo formado por la
chaperona hsp90 y las inmunofilinas de alto peso molecular (IMMs) debe
disociarse del receptor (un paso conocido como “transformación”). Este modelo
ha sido aceptado heurísticamente durante más de una década, aunque carece de
sustento experimental. Nosotros proponemos un modelo para el mecanismo de
acción de receptores esteroidales (el que también podría ser válido para otras
proteínas solubles) en el cual el complejo hsp90•IMM asociado al receptor es
requerido para el transporte retrógrado de éste sobre los filamentos del
citoesqueleto, siendo la proteína motora dineína, la que provee la fuerza
motriz para este movimiento. Como corolario, se debe inferir que la transformación
debería ocurrir cuando el heterocomplejo receptor•hsp90•IMM es transferido a la
maquinaria que lo translocará a través del poro nuclear o una vez que se
encuentre en el nucleoplasma.
The hsp90•high molecular weight immunophilin
heterocomplex as a molecular machinery for soluble
protein trafficking
ABSTRACT
Although movement of proteins comprised in vesicles is known
to occur on cytoskeletal tracts, the movement of non-vesicle associated
proteins is unknown. Soluble proteins such as MAPKs, STATs, p53, NFkB, steroid
receptors, cyclins, etc. are not confined to the cytoplasm or the nucleus in a
static manner, but are capable of shuttling dynamically through the nuclear
pore even when the number of molecules in a given compartment is overwhelmingly
larger than the small number located in the other compartment. Moreover, it has
always been posited that soluble proteins move by diffusion. Protein
mistargeting has dire cellular consequences and leads to a large variety of
pathologies, including cancer. In this regard, more than 200 diseases have been
related with failures in the transport or mislocalization of proteins.
Therefore, a major unsolved problem that pertains to all signaling pathways
relates to how proteins move to their sites of action. Corticosteroid receptors
constitute an excellent system for studying protein movement. They are
primarily located in the cytoplasm in the absence of ligand and rapidly move
towards the nucleus with ligand. A classical model proposed more than a decade
ago posited the notion that, upon steroid binding, the hsp90•immunophilin
(IMM)-heterocomplex must dissociate from the receptor (a process normally
referred to as “transformation”), which in turn, permits its nuclear
translocation. Although heuristic, the model has no substantial experimental
support. Our experimental evidence shows that the hsp90•IMM complex is required
for the retrograde movement of corticosteroid receptors (and perhaps, for
others soluble factors), the motor protein dyenin being the responsible for
powering this movement along cytoskeletal tracts. As a consequence, it may be
inferred that transformation of the receptor•hsp90•IMM should take place when
the heterocomplex is transferred to the translocation machinery responsible for
its passage through the nuclear pore or when the receptor is nucleoplasmic.
Introducción
Durante los últimos años se ha
evidenciado un incremento exponencial en el número de estudios que han
relacionado a los factores involucrados en las cascadas de señales con su
redistribución en los distintos compartimientos celulares como consecuencia de
variados estímulos. Este inusitado interés por estudiar la distribución de
proteínas solubles no es sorprendente si consideramos la importancia que poseen
muchos de estos factores en el normal funcionamiento de la célula, tal que una
redistribución incorrecta conlleva casi ineludiblemente a un desbalance funcional que no sólo se traduce en algún tipo
de patología grave, sino irreversible.
Hoy resulta claro que la mayoría de las
proteínas solubles no se encuentran estáticamente confinadas en un
compartimiento celular dado sino que son transportadas de manera constante y
dinámica entre ellos (1-4), lo que representa un paso esencial en el
mecanismo molecular para que tales factores adquieran o repriman determinado
tipo de funciones. Resulta un hecho indiscutido que proteínas englobadas en
vesículas deben viajar a sus destinos finales (p.ej.,
el terminal axónico o la membrana plasmática) por un
mecanismo activo de transporte en donde las vesículas requieren de proteínas
motoras asociadas a componentes del citoesqueleto (5-8). Este concepto se encuentra muy arraigado
para las proteínas vesiculares, pero no ocurre lo mismo con las proteínas
solubles. En la mayoría de los casos, los investigadores nos hemos concentrado
en analizar el transporte de estos factores solubles considerando desde y hacia
dónde se produce tal tránsito, pero raramente nos hemos preguntado cómo se
mueve tal factor desde y hacia sus sitios de acción. En este sentido, el
concepto histórico que aún hoy persiste, es aceptar por omisión que las
proteínas difunden y se concentran en sus sitios de acción según el equilibrio
entre lo “libre” y lo “unido”.
Podemos imaginar que una proteína
soluble viaja por simple difusión y que, al colisionar de manera estocástica
con otras proteínas estructuralmente complementarias o con determinadas
estructuras celulares, podría quedar atrapada en su sitio de acción. Este
modelo proveería una explicación simple para comprender la distribución
intracelular de los factores solubles e implica la existencia de un primer paso
en el que el factor en cuestión deba distribuirse por todos o casi todos los
compartimientos a los que tiene acceso, para finalmente concentrarse en su
sitio de acción al quedar “atrapado” en él por interacciones moleculares
específicas.
A priori, esta explicación no se condice con la eficiencia, eficacia y
especificidad con las que funcionan las proteínas relacionadas a las cascadas
de señales. Además, eventos celulares críticos dependientes de un mecanismo de
transporte basado exclusivamente en procesos fisicoquímicos que resultan en la
colisión estocástica de factores solubles también se encuentra en inevitable
colisión con dos conceptos biológicos elementales como son la especificidad de
acción y el principio de compartimentalización celular.
Es un hecho fácilmente comprobable
que una proteína soluble fácilmente visible, p.ej.,
por estar fusionada a GFP (green fluorescent protein), puede
distribuirse en forma casi homogénea por todo el espacio citoplasmático o
nuclear, según le corresponda a su localización primaria. En otras palabras,
los procesos fisicoquímicos que rigen el modelo clásico tienen lugar y la
difusión de proteínas solubles es un hecho. No obstante ello, cabe preguntarnos
si este mecanismo de distribución de factores en la célula se condice con sus
funciones biológicas ¿Cómo compatibilizar entonces el hecho de que
una cascada de señales se active y no lo hagan otras que potencialmente se
dispararían por el/los mismo/s intermediario/s?
Los efectos
biológicos requieren de la activación de moléculas específicas, localizadas en
dominios determinados y, fundamentalmente, en un tiempo de activación
apropiado, requisitos todos ellos que no se explican con el modelo antes descripto. Es más razonable imaginar un modelo en el que
las proteínas se focalicen en forma rápida y
eficiente a sus sitios de acción tal que éstos y no otros se activen en primer
término, permitiendo que al mismo tiempo se activen (o no, según la
conveniencia biológica de hacerlo) los mecanismos de represión para silenciar o
modular a aquéllas cascadas que también podrían activarse a posteriori, es decir, cuando el factor ha difundido por todo el
compartimiento.
Podría
entonces plantearse un modelo que compatibilice el modelo “clásico” basado en
el movimiento estocástico de los factores solubles y el “focalizado”
hacia sus sitios de acción si imagináramos cierta vecindad entre los
componentes de la maquinaria molecular de activación de un proceso biológico,
lo que proveería cierto grado de especificidad de la respuesta dentro de un
marco de tiempo adecuado ¿Qué ocurre entonces cuando los componentes no están
tan próximos y la señal debe viajar? Para focalizarla
hacia un sitio dado podríamos asignarle un rol a los filamentos del citoesqueleto, los que están altamente cargados y delimitan
callejones polianiónicos capaces de interaccionar con
los grupos cargados de las proteínas en movimiento. Si éstas poseyeran sitios
ricos en aminoácidos básicos como arginina y lisina,
los que estarán protonados a pH
fisiológico, se restringiría la difusión de la proteína soluble debido a
interacciones electrostáticas con los filamentos, mientras que aquéllas que
fueran más aniónicas verían restringidas tales interacciones por repulsiones
electrostáticas que “dirigirían” la difusión en una trayectoria más
restringida. Además, la velocidad de la difusión se podría regular por cambios
en la arquitectura y composición de los filamentos del citoesqueleto,
aunque estos cambios, si bien dinámicos y rápidos, serían aún lentos comparados
con la velocidad de migración de las proteínas solubles. Además, si bien este
modelo otorga cierta direccionalidad al movimiento
así como cierto grado de regulación de la velocidad de migración del factor
soluble, sigue delegando la responsabilidad de procesos biológicos básicos a
una migración estocástica y no del todo regulable en los cortos tiempos
requeridos para ciertos procesos. También se puede argüir que complejos
macromoleculares como los formados por los SRs con
las chaperonas, co-chaperonas, IMMs
y proteínas regulatorias (9), se verían limitadas
grandemente en cuanto a su velocidad de difusión “dirigida”. Se ha determinado
que la velocidad de difusión en las zonas adyacentes a los filamentos se
encuentra grandemente retardada debido al alto grado de compactación de
complejos que tornan el medio sumamente viscoso (10, 11).
Un mecanismo
alternativo para el movimiento de proteínas solubles y que haría compatible tal
transporte con la eficacia, eficiencia y especificidad con las que ocurren en
la célula implicaría el uso de la maquinaria molecular de transporte de
vesículas ya existente en la célula para el transporte de los factores
solubles. Recientemente, la visualización del interior celular por tomografía crioelectrónica evidenció que el citoplasma se encuentra
altamente compactado con filamentos del citoesqueleto
y macromoléculas solubles que parecieran asociarse a esos filamentos (11), lo que sería más compatible
con la existencia de unidades funcionales que con un transporte mediado por
simple difusión. Para estudiar este posible mecanismo, hemos utilizado a los
receptores de esteroides (SRs) como modelo. Esto es
porque es muy simple regular la localización subcelular de los mismos por parte
del operador. El receptor de glucocorticoides (GR) o
el de mineralocorticoides (MR) será primariamente
citoplasmático en ausencia de ligando, mientras que translocará
rápidamente al núcleo por agregado de la hormona. Cuando ésta es retirada del
medio, el receptor recicla al citoplasma y queda a la espera de un nuevo
estímulo para migrar nuevamente al núcleo (12, 13).
El complejo SR•hsp90•IMM
Para
comprender mejor cómo se mueven los SRs en la célula,
primero debemos explicar sus propiedades. Los SRs son
factores de transcripción que se activan por ligando
y que forman una subfamilia dentro de la superfamilia de receptores nucleares (14). Varios miembros de esta
familia presentan la propiedad de ser mayoritariamente citoplasmáticos en
ausencia de ligando (GR, MR, AR, VDR, AhR, CAR,
etc.), mientras que otros son constitutivamente nucleares (PR, ER, ERR, TR, RAR,
etc.). Todos ellos se concentran en áreas nucleares determinadas cuando unen
ligando. Ya sea que el equilibrio se desplace hacia el citoplasma o hacia el
núcleo, todos los factores se encuentran sujetos al tránsito dinámico entre
ambos compartimientos.
La
estructura básica de un receptor nuclear se muestra en la Fig.1 y consiste en
cinco ó seis regiones (según el receptor) nombradas con letras (de la A a la E-F). No obstante esta nomenclatura moderna (15), las diferentes regiones
continúan siendo llamadas por sus nombres convencionales, los que se utilizarán
en este artículo. La región central (o C) es la mejor conservada, por lo que se
la utiliza como patrón de comparación filogenético. La región C es la
responsable de la unión del receptor a las secuencias específicas en el ADN,
por lo que convencionalmente nos referimos a ella como región DBD (DNA-binding
domain). La misma incluye a dos regiones
adyacentes plegadas como un rulo alrededor de un catión Zn2+ y que
delimitan las dos áreas del tipo “Zn-fingers”
(dedos de Zn) responsables de la interacción directa
con la doble hélice del ADN. La región E-F que se encuentra hacia el extremo
C-terminal del receptor tiene un moderado grado de conservación que varía según
los receptores que se comparen entre sí, y que es responsable del
reconocimiento de la hormona. Su nombre convencional es LBD (ligand-binding domain). El LBD está separado del aminoácido
C-terminal por una secuencia pequeña y no conservada (región F) cuya función no
se encuentra bien definida, pero que podría conferirle al SR especificidad de
ligando y/o de actividad transcripcional. En el LBD
se identifican la secuencia responsable de la dimerización
de los SRs y una secuencia llamada AF-2 (activation function-2)
que confiere la especificidad transcripcional según
el ligando unido. Finalmente, en la mitad N-terminal del receptor se encuentra
una región hípervariable (A-B) que se asocia a la
actividad transcripcional relativamente independiente
de ligando, es el dominio TD (transactivation
domain). Aunque el dominio TD es muy
variable entre los miembros de la subfamilia, se encuentra muy conservado
evolutivamente para un receptor dado (16).
Figura 1. Arquetipo de
receptor nuclear
En el caso
de la subfamilia de SRs, sus miembros no existen
aislados sino en forma de heterocomplejos con
chaperonas y co-chaperonas. Las chaperonas
constituyen una familia de proteínas altamente conservadas en la evolución que
participan en el correcto plegado y ensamble de las proteínas, un proceso en el
que frecuentemente se requiere la hidrólisis del ATP mediada por la actividad
de ATPasa de la chaperona (17). Por otra parte, las co-chaperonas asociadas a la chaperona primaria las
“asisten” en su función. La mayoría de las chaperonas (cuyo arquetipo es
hsp70), poseen la propiedad de plegar a las proteínas desnaturalizadas tanto in vitro como in vivo. Hay otras chaperonas las que,
si bien poseen la capacidad de recuperar el correcto plegado de proteínas
desnaturalizadas en un sistema libre de células, en células intactas
interaccionan con aquéllas proteínas celulares que ya poseen cierto grado de
organización en su estructura terciaria, lo que favorece entonces la maduración
de la estructura de la proteína “cliente” antes que el plegamiento terciario
elemental y, consecuentemente, les confirieren funcionalidad (18, 19). El típico ejemplo es hsp90,
la chaperona esencial que constituye el centro de gravedad del heterocomplejo asociado a SRs.
Si bien los
complejos SR•hsp90 son fácilmente aislados de extractos citosólicos,
hsp90 purificada no se une a GR. No fue sino hasta cuando se tradujo a GR en lisados de reticulocitos que se
pudo estudiar cada paso del ensamblado del heterocomplejo
en extractos libres de células, lo que llevó al relativamente reciente modelo
que se esquematiza en la Fig.2 (17). El apo-GR
(no asociado a chaperonas) no tiene capacidad de unir ligando debido a que el
LBD se encuentra colapsado impidiendo el acceso del esteroide a su sitio de
unión. El complejo hsp90•hsp70 preexiste en el citosol
gracias a la acción de la chaperona Hop (heat-shock-organizing protein),
antiguamente conocida como p60, la que actúa de puente entre el dímero de hsp90
y una molécula de hsp70 (el nombre Hop alude a su
función de proteína “organizadora”). Normalmente, hsp40 siempre se encuentra
asociada a hsp70 y es requerida en cantidades subestequiométricas
para favorecer este proceso de ensamblado.
Luego, el
complejo (hsp90)2•Hop•hsp70/hsp40, al que hemos llamado “foldosoma”, se transfiere de manera ATP/Mg2+ y K+ dependiente al aporreceptor,
tal que favorece la “apertura” del LBD y por ende, la entrada del ligando. En
consecuencia, la principal diferencia de este complejo intermedio GR-chaperonas
con respecto al aporreceptor es que GR será ahora
capaz de unir hormona (20, 21). Una vez que el complejo se
ha formado, la pequeña co-chaperona acídica p23 se asocia dinámicamente al dímero de hsp90
estabilizando el complejo. Tal función estabilizante
puede ser reemplazada por agregado de molibdato de
sodio al buffer de homogenización.
Resulta
importante enfatizar que Hop es una proteína que
presenta secuencias TPR (tetratricopeptide repeats),
es decir, secuencias de 34 aminoácidos que se repiten en tándem
y que son importantes para las interacciones proteína-proteína (22). Hop
se une al sitio aceptor para proteínas TPR presente en el dímero de hsp90 de
manera mutuamente excluyente con otras proteínas TPR, tal que cada dímero de
hsp90 poseerá asociado sólo una proteína TPR dada (23).
Una vez que
se ha formado el heterocomplejo entre las chaperonas
y el receptor, Hop se disocia del mismo dejando un
intermediario que posee el sitio aceptor TPR vacante. Dependiendo del tipo
celular y las condiciones de estrés a las que se las somete, hsp70 puede o no
abandonar al heterocomplejo en este paso. El sitio
TPR que queda vacante se completa en el estadio final con otras proteínas que
poseen secuencias TPR y que resultarán esenciales para la estructura final del
complejo maduro, son las inmunofilinas de alto peso
molecular (IMM).
Inmunofilinas
Las inmunofilinas constituyen
una familia de por lo menos 35 proteínas codificadas en diferentes genes y que
presentan la particularidad de unirse o bien a la drogas inmunosupresoras
rapamicina y FK506 (subfamilia FKBP, por FK506-binding protein) o a la droga ciclosporina-A
(subfamilia CyP, por cyclosporin-binding protein)
(24, 25). Los arquetipos de IMMs asociadas a la inmunosupresión
son las IMMs de bajo peso molecular FKBP12 (12-kDa) y CyP-A (17-kDa). El efecto inmunosupresor se
debe a que el complejo droga-IMM actúa como inhibidor de la subunidad
catalítica de la calcineurina (o fosfatasa
PP2B dependiente de Ca2+/calmodulina), la
que no desfosforila entonces al factor transcripcional NF-AT (nuclear
factor of activated
T-cells) de los linfocitos T, éste no
migra al núcleo y consecuentemente se inhibe la producción de interferón-γ e interleuquinas (26).
En el caso
de las IMMs de alto peso molecular, la función no
está del todo definida. Como ocurre con la mayoría de los miembros de la
familia, estas IMMs unen a las drogas inmunosupresoras, pero no están relacionadas de modo alguno
con la inmunosupresión. Varias de estas IMMs de alto peso molecular son chaperonas y se recuperan
asociadas a los receptores de esteroides. La Fig. 3 muestra la estructura
comparativa de las cinco IMM hasta hoy descriptas como partes del heterocomplejo SR•hsp90 (25). El dominio característico de
las IMMs es el dominio PPIasa
(celeste), lugar en donde se une la droga inmunosupresora
y reside la actividad enzimática de rotamasa o peptidil-prolil isomera (PPIasa), lo que significa que una IMM puede transformar
uniones peptídicas X-Pro de cis a trans y viceversa. Esta actividad
enzimática es muy evidente en ensayos in vitro con oligopéptidos, pero los resultados no son aún contundentes
para afirmar fehacientemente que afecta la estructura terciaria de las
proteínas en el entorno celular, aunque es muy probable que así sea.
Figura 3. Estructura de IMMs
asociadas a SRs
Los dominios
TPR de estas IMMs son representados en anaranjado y
son los responsables de su asociación con hsp90.
Comparativamente,
las IMMs de bajo PM CyP-A y
FKBP12 equivalen sólo al dominio PPIasa de las de alto
PM (entre los cuales hay una homología significativa), pero carecen de dominios
TPR por lo que no se asocian al sitio aceptor presente en el dímero de hsp90.
FKBP52,
FKBP51 y CyP-40 se encuentran en cantidades
significativas en los complejos con SRs. La IMM XAP2
(también conocida como ARA9 ó AIP) es exclusiva del receptor AhR (receptor de aril-hidrocarbono o receptor de dioxano),
el que tiene la propiedad de no
asociar a las otras IMMs, sino sólo a XAP2 (27).
Recíprocamente,
aquéllos SRs que sí unen a las otras IMMs, no interaccionan con XAP2. Finalmente, PP5 es una
Ser/Thr fosfatasa que posee
un dominio “IMM-like”
que une FK506 (aunque carece de actividad enzimática)
y que es un componente mayoritario del heterocomplejo
(12, 28, 29), aunque se desconoce al
presente si su actividad de fosfatasa afecta la
fisiología del receptor al que está unido.
Las IMMs
de alto PM unen dineína
Una propiedad interesante de las IMMs
de alto PM es que se unen a la proteína motora dineína
(30), la que es responsable del
transporte retrógrado de vesículas. Por otra parte, a una parte de la fracción
citoplasmática de las IMMs de alto PM se las
visualiza asociadas a los microtúbulos (31). Además, como las IMMs son parte del heterocomplejo
de los SRs, se puede inferir que éstos se mueven hacia
el núcleo sobre los filamentos del citoesqueleto
utilizando a la dineína como fuerza motora. Esta
hipótesis se vió potenciada cuando al inmunoprecipitar a GR no sólo se co-inmunoprecipitó a hsp90 y a las IMMs,
sino también a dineína (30).
Con el
objeto de analizar cómo son las interacciones en el heterocomplejo,
se inmunoprecipitó a GR, luego se disociaron las
proteínas endógenas co-inmuno-precipitadas
por incubación en un buffer de alta fuerza iónica y, finalmente, se reincubó a GR “desnudo” con lisado
de reticulocitos (RL) más un sistema regenerador de
ATP a fin de reconstituir el complejo sobre el receptor en varias condiciones (30). Cabe aclarar que en el RL no
expresa GR, pero sí posee todas las proteínas del heterocomplejo.
Los resultados se muestran en la Fig.4.
Figura 4. Modelo de ensamblado del transportosoma. El receptor de glucocorticoides (GR) fue inmunopre-cipitado con una IgG específica o
in-mune (I) o un control no inmune (NI). Las
proteínas endógenas fueron diso-ciadas con fuerza
iónica y el GR “desnudo” fue incubado con lisado de reticulocitos (RL) suplementado con el inhibidor de hsp90 geldanamicina (GA), el péptido recombinante
corres-pondiente al dominio TPR de la IMM, o el
péptido correspondiente al domi-nio
PPIasa. El complejo reconstituído
fue revelado por Western blotting. El
modelo inferido a partir de estos resultados se esquematiza en la parte
inferior de la
figura.
El control
no incubado con RL muestra que el tratamiento con alta fuerza iónica ha
disociado a todas las proteínas unidas a GR, las que se reensamblan al reincubar con RL, incluyendo a la proteína motora dineína. En este experimento se muestra sólo a la cadena
intermedia de dineína (responsable de interactuar con
la “carga”), pero también se co-inmunoprecipitan
las cadenas livianas y pesadas de la proteína motora. Tubulina
sigue el mismo patrón que dineína si la
homogenización se realiza en un buffer
que preserva el grado de polimerización de los microtúbulos.
Cuando la incubación con RL se
realizó en presencia del inhibidor de hsp90 geldanamicina
(GA) (32) no se reconstituyó el
complejo, indicando que dineína no se une en forma
directa al receptor. Cuando se saturó al RL con el péptido TPR a fin de inhibir
la unión de la IMM FKBP52 al complejo GR•hsp90, no se recuperó dineína. Ello indicó que la misma tampoco se une al dímero
de hsp90. Al saturar el sistema de reconstitución con el dominio PPIasa de la IMM, se restaura eficientemente el complejo
GR•hsp90•FKBP52, pero la dineína es competida de
manera dependiente de la concentración de PPIasa sin
que se afecten las otras proteínas del complejo, lo que nos indicó claramente
que la proteína motora se une al dominio PPIasa de la
IMM. Con posterioridad, se demostró que esta propiedad es compartida por CyP-40 y PP5 (31). El modelo diagramado en la parte
inferior de la Fig.4 representa al complejo SR•hsp90•IMM•proteína motora (o “transportosoma”) inferido a partir de estos experimentos.
El complejo hsp90•IMM•dineína
es esencial para el retrotransporte de SRs
Estos
resultados fueron obtenidos en un sistema libre de células, por lo que aún quedaba
la duda de si el transportosoma cumple la función de
transportar al receptor en una célula intacta. Siguiendo el mismo razonamiento
que el de estos ensayos, se postuló entonces que los mismos tratamientos
deberían inhibir el movimiento retrógrado de GR en una célula. Fibroblastos NIH
3T3 fueron transfectados con la proteína de fusión
GFP-GR (green fluorescent protein-GR) y crecidos en un medio libre de esteroide
(Fig.5-A); luego de 20 min de agregada la hormona,
GFP-GR se concentró en el núcleo (Fig.5-B), mientras que el tratamiento de las
células con GA (Fig.5-C) o la sobreexpresión del
dominio PPIasa (Fig. 5-D)
inhibieron parcialmente su translocación nuclear (30).
Para nuestra
sorpresa, cuando la incubación con hormona se extendió a una hora, la
fluorescencia se concentró en el núcleo en las células en donde se había visto
inhibición (aquéllas mostradas en los paneles 5-C y 5-D). Estos resultados
indicaron que si bien el transportosoma es requerido
para el transporte rápido y eficaz de GR al núcleo, existiría un mecanismo
alternativo de movimiento que es claramente independiente del complejo
hsp90•IMM (¿simple difusión?). Cabe destacar que si se tratan células transfectadas con dominio PPIasa
con GA, la curva de translocación no es diferente de
aquéllas observadas para cada tratamiento individual, indicando que la
maquinaria molecular que se afecta es la misma.
Figura 5. Translocación
nuclear de GR. Células NIH-3T3 transfectadas
con GFP-GR fueron crecidas en un medio libre de esteroide y tratadas por 20 min con vehículo (A) ó 100 nM dexametasona (B,C
y D). Las células del panel C fueron preincubadas con hormona durante 1 h sobre
hielo para favorecer la unión de esteroide y evitar la translocación
de GR al núcleo. Luego fueron incubadas con el inhibidor de hsp90 GA durante 20
min adicionales. El tiempo cero en el gráfico
representa el momento en el que las células se llevaron a 37oC. Las
células del panel D sobreexpresan al dominio PPIasa. El gráfico inferior muestra la velocidad de translocación a núcleo en células control (anaranjado),
tratadas con GA (azul) y las que sobreexpresan el
dominio PPIasa. La flecha negra marca el tiempo en el
que se tomaron las fotografías de los paneles A-D.
Si fuera
correcto el modelo que surge de estas observaciones y que sostiene que el
complejo hsp90•IMM actúa como “puente” entre el factor a ser transportado y la
proteína motora dineína, es lógico predecir que la
disrupción de los componentes moleculares de dicha maquinaria de transporte
debería afectar la movilidad del factor en cuestión. Que éste es el caso lo
prueban los tratamientos en los cuales se afectó la función de la hsp90 (con
GA) y la interacción entre la IMM y dineína (por
competencia del sitio de interacción con el dominio PPIasa).
En este
punto tendríamos que aclarar que la actividad motora de dineína
requiere de su asociación a un complejo multiproteico
llamado dinactina tal que, para ser más precisos, se
debería hablar del complejo dineína/dinactina como un todo (33, 34). En trabajos realizados sobre
el transporte de vesículas del Golgi se describió que
la sobreexpresión de una de las once subunidades que componen la dinactina,
la proteína p50/dinamitina, produce el desensamble de
todo el complejo (35), tal que aún cuando dineína todavía conserva la capacidad de unirse a las
vesículas del Golgi, no genera la fuerza motriz
necesaria para que éstas sean transportadas a lo largo del citoesqueleto.
Análogamente, se puede postular que la sobreexpresión
de p50/dinamitina debería afectar el movimiento
retrógrado de SRs.
La Figura 6
muestra una inmunofluorescencia indirecta para MR en
un cultivo primario de células del ducto colector
renal que fueron transfectadas con myc-p50/dinamitina, depri-vadas de esteroide y tratadas con 10 nM
aldosterona durante 20 min. Las flechas indican a
aquéllas células en las que la translocación de MR se
vió inhibida por la sobreexpresión
de p50/dinamitina. Similares resultados fueron
obtenidos para GR en fibroblastos NIH-3T3 (36). No obstante, la curva de
tiempo para la translocación de MR al núcleo demostró
que al cabo de 1 h de incubación con aldosterona, MR
es totalmente nuclear. Este efecto es indistinguible de aquél descripto en la Fig.5 con GA y la sobreexpresión
del dominio PPIasa. En conclusión, el complejo dineína/dinactina es responsable
del movimiento retrógrado de los receptores de corticosteroides,
aunque el transporte puede ocurrir de manera más ineficiente en ausencia de la
maquinaria molecular aquí descripta.
Figura 6.
Efecto inhibitorio de dinamitina sobre MR
En este
punto cabe preguntarnos ¿para qué posee la célula un mecanismo de transporte
tan complejo si cuando éste falla la proteína igualmente alcanza su sitio de
acción? Una primera respuesta se obtiene al rescatar aquél concepto que
mencionamos en la Introducción: el tiempo de activación de una cascada de
señales es crítico para obtener la respuesta biológica necesaria o deseada.
Desde un punto de vista funcional, claramente no es lo mismo que el factor
alcance su sitio de acción con una t0,5 para
la translocación nuclear de 4-5 min
(como ocurre fisiológicamente con los SRs) a que lo
haga con un t0,5 de 30-40 min, tal como se
observa al desacoplar a los componentes del transportosoma
(id est,
inhibiendo a hsp90 o desacoplando el complejo con el péptido PPIase o con p50/dinamitina).
Una segunda
pregunta que surge de este modelo es si los factores solubles ven impedido su
movimiento cuando las distancias que deben recorrer son más grandes que las que
separan a cualquier punto del citoplasma de una célula convencional de su
núcleo. Un ejemplo de este caso son las neuronas, cuyos axones pueden alcanzar
hasta un metro de longitud y en los que, consecuentemente, la eficiencia de un
proceso de difusión (o del mecanismo alternativo que sea responsable del
movimiento de los SRs) sería incompatible con la
vida.
Para
responder a este interrogante, se transfectaron
neuronas humanas NT2 con GFP-GR y se analizó la localización del receptor por
estímulo con dexametasona en células tratadas con GA,
es decir, la misma condición descripta en la Fig.5-C (37). Los resultados se muestran
en la Fig.7.
Figura 7. Geldanamicina
produce la agregación de GR activado por dexametasona
(DEX).
GFP-GR se visualizó diseminado tanto en el cuerpo celular
como en las neuritas y migró rápidamente al núcleo por agregado de dexametasona. Sin embargo, aún pudo apreciarse
fluorescencia en las neuritas y fue necesario aguardar una hora para que toda
la población de receptores se concentre en el compartimiento nuclear. Como
ocurrió con los fibroblastos (Fig.5), GA no afectó la distribución del receptor
per se e inhibió la translocación
al núcleo en presencia de hormona. Sin embargo, GFP-GR se agregó tanto en el
cuerpo celular como en las dendritas (flechas amarillas), siendo este agregado
dependiente de ambos, GA y esteroide, ya que no se lo observó con cada uno de
ellos individualmente. Al cabo de 1 h, el receptor se concentró en el núcleo,
pero aún pudieron verse agregados de GFP-GR en las neuritas. Estos agregados
desaparecieron cuando el medio fue reemplazado por uno conteniendo el esteroide
pero no GA, lo que indicó que el proceso es reversible. No obstante, al cabo de
4 h con esteroide y GA la fluorescencia desapareció de las neuronas, un evento
que se inhibió en presencia de inhibidores del proteasoma.
Estos resultados indicaron que el movimiento alternativo (¿difusión?) no
dependiente del complejo hsp90•IMM es tan ineficiente que el receptor se
acumula en ciertas partes de su trayectoria (¿puntos de control de calidad del
sistema de transporte?) y finalmente, se degrada. En otras palabras, el
mecanismo alternativo de movimiento podría resultar relativamente útil para
distancias cortas como las que hay en el cuerpo celular respecto del núcleo,
pero es totalmente ineficaz para distancias mayores como las que debe recorrer
un factor soluble en las neuritas. La interpretación de que los agregados que
se muestran en la Fig.7 son centros de degradación del proteasoma
fue confirmado por la visualización de las chaperonas hsp70 y CHIP que colocalizan con estos gránulos. El reclutamiento de hsp70
al proteasoma es una condición sine qua non para la degradación de GR y CHIP actúa como la E3 ubiquitina ligasa de GR (38).
Tomadas en
su conjunto, las evidencias experimentales descriptas hasta acá permiten
afirmar que el retrotransporte de SRs
ocurre de manera activa gracias al complejo hsp90•IMM, el que actúa como puente
entre la carga y la proteína motora. El modelo presupone que hsp90 no debe
disociarse inmediatamente después que la hormona se ha unido al receptor puesto
que su asociación con hsp90 es aún necesaria para el transporte. Luego, el
proceso de transformación de SRs debería ocurrir en
un paso subsiguiente al retrotransporte, aunque
previo a la unión del receptor a sus secuencias específicas en el ADN.
El complejo hsp90•IMM•dineína
en el factor proapoptótico p53
La pregunta
que surge es si otros factores que están asociadas a hsp90 también requieren
del complejo hsp90•IMM para su movimiento hacia el núcleo. El factor proapoptótico p53 constituye un caso interesante ya que en
el 50-60% de los procesos tumorales, p53 se deslocaliza
del núcleo hacia el citoplasma, en donde permanece asociado a hsp90 (39, 40). El primer paso fue
determinar si los componentes del heterocomplejo que
habían sido descriptos para SRs también se hallaban
presentes en p53 (además de hsp90). La inmunoprecipitación
de p53 de extractos de células DLD-1 (carcinoma de cólon
humano) demostró que todas las proteínas descriptas en los complejos maduros de
GR también forman parte de p53 (41). Como hallazgo muy
importante, cabe mencionar que las IMMs y dineína fueron co-inmunoprecipitadas con p53, y que la asociación de las
primeras al factor proapoptótico sigue las reglas
generales de interacción antes descriptas en los experimentos de reconstitución
con GR. Efectivamente, la incubación de p53 inmuopurificada
con RL brindó los mismos resultados que aquéllos observados en la Fig.4 con GR.
Con el fin
de demostrar que luego de su activación p53 utiliza la misma maquinaria de
transporte que los SRs, se utilizaron células
HT29-tsp53, las que sobreexpresan establemente una
mutante termosensible de p53 de ratón. Esta mutante
permanece en el citoplasma cuando las células crecen a la temperatura no
permisiva de 39oC (Fig.8). Cuando la temperatura se cambió a 32oC,
p53 translocó al núcleo a menos que las células
hubieran sido transfectadas con el dominio PPIasa de la IMM o con la subunidad
p50/dinamitina de dinactina
(41). Estos resultados pueban que la maquinaria molecular de transporte para p53
es la misma que la descripta para SRs. La diferencia
notable en ambos sistemas es que en el caso de p53, el factor permanece en el
citoplasma y no continúa moviéndose hacia el núcleo como sí lo hacen los SRs. Aquélla propiedad de p53, que es la que esperábamos observar
y no vimos con los SRs, podría deberse a diferencias
en el tipo de señal de localización nuclear que posee respecto de los SRs, lo que hace que éstos y no el factor proapoptótico igualmente transloquen
al núcleo cuando se desensambla el transportosoma. La
misma especulación es válida para el efecto inhibitorio sobre el movimiento de SRs y p53 que hemos observado cuando utilizamos drogas que
desagregan el citoesqueleto (20).
Figura 8. Inhibición de la translocación
nuclear de p53
Los resultados experimentales aquí descriptos demuestran
claramente que el complejo hsp90•IMM es un componente esencial de la maquinaria
de transporte de factores solubles como los SRs y
p53, y que dicho transporte requiere de la acción motora de dineína.
Es muy probable que esta maquinaria de transporte sea utilizada por la mayoría
de las proteínas que se asocian a hsp90 y/o las IMMs
de alto PM, pero el interrogante que aún debemos explorar es cómo se
transportan aquéllas proteínas que no se asocian a hsp90 y/o IMMs. En estos casos ¿es la difusión una alternativa
válida?
Ya hemos
visto que la difusión (o el mecanismo de transporte alternativo que sea) no es
ni siquiera una alternativa posible para el transporte cuando las distancias a
recorrer por la proteína son grandes (Fig.7). Además, no es aún claro si el
mecanismo no asistido por hsp90•IMM en células distintas a las nerviosas es
relevante desde el punto de vista fisiológico.
Como expresamos
anteriormente, la principal extrapolación que puede hacerse del modelo asistido
de transporte aquí descripto para SRs
es que, en contra de lo que se ha aceptado à bouche ouverte desde siempre, la unión de hormona no debería
promover la inmediata disociación de hsp90 puesto que ésta es requerida para el
transporte. Cuando realizamos una inmunoprecipitación
de GR a partir de la fracción nuclear soluble (GR aún no asociado al ADN),
encontramos que a los 10 min de incubación de las
células con hormona (cuando GR es >95% nuclear), hsp90 fue recuperada con
esa fracción de GR nuclear a un nivel equivalente al que se observa hsp90
cuando se inmunoprecipita al receptor citoplasmático.
Luego de 15 min ya no se recupera GR soluble en el
núcleo sino unido a la cromatina, lo que sugiere que el proceso de
transformación debería ocurrir en el nucleoplasma
entre los 10 y 15 min de agregado el ligando.
Si poco se
sabe acerca de cómo las proteínas solubles se mueven en el citoplasma, nuestro
conocimiento sobre el mecanismo de movimiento de las mismas en el núcleo es
casi inexistente, y hacia ese objetivo hemos dirigido una de nuestras líneas de
trabajo actuales.
Agradecimientos
Los
experimentos descriptos en este artículo fueron financiados en parte por
subsidios otorgados por la Fundación Antorchas, la Fundación Instituto Leloir, el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Técnicas, y la Agencia de Promoción Científica y Tecnológica (PICT 01-14123).
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*Dr. Mario Galigniana,
Investigador Independiente de
CONICET
|
Revista QuímicaViva Número 2, año 4, septiembre 2005 quimicaviva@qb.fcen.uba.ar |