Riva D., Perfetti X., Gadaleta P., Coulombié F. y Mersich S. Laboratorio de Virología, Departamento de Química Biológica, FCEyN, UBA.
COMPARACIÓN DE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR LOS VIRUS DE VSV E INFLUENZA IN-VITRO.

Resumen

La muerte celular programada es una forma de defensa muy primitiva en los sistemas celulares. Los virus de Estomatitis Vesicular (VSV) e Influenza (Inf) son inductores de apoptosis a través de señales no conocidas totalmente, cuyo estudio puede aclarar los mecanismos de patogenia viral. En particular el virus Inf es particularmente citotóxico en células MDCK y humanas, mientras el virus VSV induce apoptosis y acción citopática en células Vero y Hela. En este trabajo se comparan distintas metodologías como tinción con cristal violeta (CV) para determinar el porcentaje de células que sobreviven a la infección, la medida de láctico deshidrogenasa (LDH) que determina el daño que se produce en la membrana celular, la tinción de Hoechst (H) para monitorear la aparición de cuerpos apoptóticos y la actividad de caspasa-3 como proteína efectora que actúa tardíamente en el proceso apoptótico. Si bien la degradación del núcleo se ve claramente cuando las células infectadas con ambos virus se tiñen con H, las densidades ópticas (DO) de elusión de CV indican más de 50 % de células sobrevivientes de la infección con el virus Inf. Para ambos virus este reactivo permite observar una relación no lineal de la apoptosis con la multiplicidad de infección, que se atribuye a la presencia de partículas interferentes. Por otra parte en las infecciones con el virus Inf los valores de LDH son equivalentes a la cinética de muerte celular, indicando una acción específica viral sobre las membranas: el mismo virus tiene altos valores de actividad de caspasa-3 (7,2 DO/mg de proteína) aun con baja multiplicidad de infección, duplicando los datos que se obtienen con VSV e indicando la posible actividad de otras caspasas en el proceso. Asimismo al ensayar la actividad antiapoptótica de un extracto vegetal sobre ambas inducciones, a traves de H, se encontro una marcada diferencia, indicadora de una señal o de moléculas efectoras distintas. Por lo tanto el análisis de los resultados de estas metodologías contribuye a diferenciar los pasos claves de cada tipo de apoptosis.

Riva D., Perfetti X., Gadaleta P., Coulombié F. y Mersich S. Laboratory of Virology, Department of Biochemistry, FCEyN, UBA.
COMPARISON OF IN-VITRO INDUCED APOPTOSIS: VSV AND INFLUENZA VIRUSES.

Abstract

Programmed Cell Death is a primitive host defence mechanism. It has been described that vesicular stomatitis virus (VSV, Indiana serotype) and Influenza virus (Inf, A/New Caledonia 20/99, H1N1) induce apoptosis that might contribute to virus-induced cell pathology, through different pathways not entirely known. Inf induces cell damage in canine and human cells, while VSV induces apoptosis in monkey and human transformed cells. The aim of this paper was to compare different methods to evaluate in-vitro cell damage. Cells were subcultured and infected at different multiplicity of infection (moi) before evaluating apoptotic cells by: a- Hoechst staining (H), to determine apoptotic bodies; b- crystal violet staining (CV), to determine the percentage of cells that survive the infection; c- lactic deshidrogenase levels (LDH) to determine cell membrane damage and d- caspase-3 (C-3) activity as an activated effector protease that represents a late hallmark of apoptosis. In VSV infection the percentage of surviving cells was inversely related to the moi, while the opposite effect was observed in Inf infection. These results indicate the presence of defective interfering particles in Inf stocks. On the other hand VSV induced less than 5 % LDH activity in comparison to Inf infection (100 %) at similar moi, indicating an Inf specific viral effect on cell membrane. When C-3 activity was analyzed, Inf induction was 3,5 fold higher than VSV induction, suggesting that other caspases might be involved in VSV-induced apoptosis. Also an extract of Trichilia glabra leaves exerted a different protection of cell cultures from viral-induced apoptosis when both viral infections were assesed. Therefore the methods described in this study help to differentiate the key mechanisms that take place.