ENSAYO COMETA EN CELOMOCITOS DE LOMBRICES (Eisenia fetida) EXPUESTAS A 2,4,6-TRINITROTOLUENO

(Comet assay on coelomocytes of 2,4,6 trinitrotoluene exposed worms (Eisenia fetida)

Prieto González E.A.1, Fuchs J.2,3, Casabé N.2,3, Oneto M.L.2, Kesten E.2. 1Grupo de Genética Toxicológica y Salud Ambiental, Centro de Investigaciones Biomédicas del Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana, Cuba. 2Toxicología y Química Legal, Departamento de Química Biológica, FCEN-UBA-Ciudad Universitaria, Pab. II, 4º P, (C1428EHA), Bs. As. 3CONICET.

ekesten@qb.fcen.uba.


La electroforesis alcalina de células aisladas en gel de agarosa o “Ensayo Cometa”, es un procedimiento de elevada sensibilidad con el que se puede determinar la frecuencia de roturas de simple cadena y sitios modificados en el ADN de las células expuestas a la acción de un agente contaminante genotóxico. En este trabajo se evalúo la sensibilidad y reproducibilidad del ensayo en celomocitos de lombrices expuestas sobre papel a concentraciones de 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) de 0, 0.2, 0.6, 1, y 3 µg/cm2. Como control positivo se empleó el H2O2 300mM. Por cada concentración, 5 lombrices adultas con un peso promedio de 300-600 mg fueron mantenidas por 8 horas en recipientes de vidrio recubiertos interiormente con papel de filtro humedecido. Posteriormente fueron colocadas en tubos de ensayo recubiertos en su interior con papel de filtro, impregnado con la solución de TNT en acetronitrilo. Las lombrices fueron expuestas por 24 horas en condiciones de luz, humedad y temperatura controladas. La viabilidad de los celomocitos obtenidos por extrusión en buffer con guayacol evaluada con Tripan Azul fue de 97%. 10 mL de fluido celómico recién extruído fueron disueltos en agarosa de bajo punto de fusión y extendidos sobre porta objetos para ser sometidos al Ensayo Cometa. Los resultados muestran una tendencia al aumento de la migración de ADN con el incremento de la dosis (p< 0.05), indicando un efecto genotóxico de la exposición a TNT en estas condiciones, y demuestra que el ensayo de lombrices en papel puede ser un método rápido y reproducible de evaluar los efectos de contaminantes terrestres sobre el ADN.

Agradecimientos: A la Universidad de Buenos Aires, por el subsidio TX34/1998-2000.


The alkaline single cell gel electrophoresis (Comet assay), is a highly sensitive procedure, which allows quantitating the frequency of DNA single strand breakage and alkali labile sites, on cells exposed to a genotoxic contaminant. In this work, we evaluated the sensitivity and reproducibility of the Comet Assay on coelomocytes of earthworms exposed to 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) impregnated filter paper. We used H2O2 300mM as positive control.

Five adult earthworms per each concentration, weighing between 300-600 mg, were placed in test tubes covered with wet filter paper, and allowed to depurate. Afterwards, they were exposed for 24 h to filter paper impregnated with acetonitrile solutions of TNT (0, 0.2, 0.6, 1, y 3 µg/cm2), under controlled light, humidity and temperature. Coelomocytes were obtained by extrusion with guaiacol buffer, and its viability, evaluated with Trypan Blue, was 95 %. 10 ml of coelomic fluid were dissolved in low melting point agarose, and placed on microscope slides for Comet assay.

Results showed a significant increase (p < 0.05) in DNA migration with increasing TNT dose, exhibiting a genotoxic effect by TNT exposure, indicating the advantages of filter paper earthworm assay as a quickly and reproducible method for testing the effects of soil contaminants on DNA.