COMPORTAMIENTO GENOTOXICO Y ANTIGENOTOXICO DE EXTRACTOS DE VALLESIA GLABRA EN EL ENSAYO COMETA
(Genotoxic/antigenotoxic behavior of Vallesia glabra extracts in Comet Assay)
García Franco S1, Prieto González EA2, Baltar OS1, Fuchs J1,3, Kesten E1, Wood EJ1,3† 1Toxicología y Química Legal, Depto. de Química. Biológica-FCEN-UBA, Ciudad Universitaria, Pab.II, (1428) Bs. As. 2 Grupo de Genotoxicología y Salud Ambiental, Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad Médica, La Habana, Cuba. 3CONICET.
ekesten@qb.fcen.uba.ar
Estudios anteriores demostraron que extractos metanólicos de hojas verdes de Vallesia glabra presentan propiedades anti-insectos y toxicidad aguda en Artemia salina, posiblemente por interferencia con las fuentes de energía celular. En este trabajo se presentan resultados de estudios de genotoxicidad mediante el Ensayo Cometa de extractos de la misma planta. Dichos extractos fueron preparados mediante el tratamiento de hojas secas molidas con metanol (M) o agua (A), con agitación suave toda la noche a temperatura ambiente. Células L929 fueron cultivadas en placas de 96 cavidades durante 24 h. antes del enfrentamiento con los extractos. El número de células por punto fue de 4 x 104. Todas las cavidades fueron observadas al microscopio 18-24 h. posteriores a la inoculación. La IC50 se calculó por la captación de los colorantes vitales Cristal Violeta (IC50 M = 0,25g/ml; IC50 A = 1,5 g/ml) y Rojo Neutro (IC50 M = 0,125 g/ml; IC50 A= 0,5 g/ml). El Ensayo Cometa (electroforesis alcalina de células aisladas en gel de agarosa) se realizó en paralelo con la evaluación de la citotoxicidad. Se utilizaron células de las cavidades tratadas hasta dosis donde no había efecto citotóxico (supervivencia superior al 75%). Las células se mezclaron con agarosa de bajo punto de fusión y se incubaron en una solución lisante a fin de favorecer la migración del ADN en una electroforesis a pH 13. Las preparaciones fueron teñidas con bromuro de etidio y evaluadas en un microscopio de fluorescencia. Se analizaron 50 nucleoides por cada concentración, en experimentos triplicados.
El daño al ADN mostró una tendencia creciente con el aumento de concentración del extracto metanólico, y una disminución significativa (r=0,978) al aumentar la concentración del acuoso, lo que puede interpretarse como el resultado de la acción diferencial de componentes de diferente polaridad sobre el material genético.
Agradecimientos: A la Universidad de Buenos Aires, por el subsidio TX34/1998-2000.
Previous studies with methanolic extracts of green leaves of Vallesia glabra demonstrated antiinsect properties, as well as acute toxicity in Artemia salina, probably by interfering the cellular energy production. Now, we studied the genotoxicity of these extracts, by means of the Comet Assay.
Dried leaves, finely powdered, were extracted with methanol (M) or water (A), by shaking overnight, at room temperature. L929 cells, grown for 24 h on 96 wells microplates (4 x 104 cells/well), were inoculated with the extracts. IC50 were determined with Crystal Violet (IC50 M = 0,25g/ml; IC50 A = 1,5 g/ml) and Neutral Red (IC50 M = 0,125 g/ml; IC50 A= 0,5 g/ml). Comet Assay (alkaline single cell gel electrophoresis) was done in parallel with cytotoxicity assay. We selected those wells where cell viability was at least 75%. Cells were mixed with low melting point agarose and lysed under mild alkaline conditions to allow DNA migration when subjected to alkaline electrophoresis. Slides were stained with ethidium bromide, and the length of migration of DNA of individual cells was analysed using fluorescence microscopy. 50 nucleoids per concentration were analysed, in three separate assays.
DNA damage showed an increasing trend with increasing concentration of methanolic extracts. On the contrary, significant decrease (r=0.978) of damage was observed when the concentration of aqueous extract increased, probably as result of the differential action on the genetic material of components which differ in polarity.